腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中差異表達microRNA的篩選及miRNA-490-5p對類胰蛋白酶的影響.pdf

1、目的:通過生物信息學分析，在腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中篩選出感興趣的miRNAs分子。針對感興趣的miRNA，通過構(gòu)建miRNA-490-5p慢病毒載體，研究miRNA-490-5p對類胰蛋白酶的影響，并探討其可能的機制，以深入闡明microRNA在腹瀉型腸易激綜合征的發(fā)生發(fā)展中的重要性，也為腹瀉型腸易激綜合征的診斷和治療提供新的思路。研究共分為二部分:一、腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中差異表達microRNA的篩選及驗證;二、腹瀉型腸

2、易激綜合征大鼠模型中miRNA-490-5p對類胰蛋白酶的影響。
　　方法：
　　一、腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中差異表達microRNA的篩選及驗證在miRDB數(shù)據(jù)庫中對本課題組前期人結(jié)腸組織IBS-D/N組miRNA芯片篩選出的差異表達顯著的72個miRNAs進行目標microRNA的篩選;用乙酸灌腸加束縛應激的方法構(gòu)建IBS-D大鼠模型，分別為正常對照組（正常組）8只、造模組（IBS-D組）16只，兩組均采用結(jié)腸敏感性

3、檢測及腹壁撤離反射(AWR)評分對其內(nèi)臟敏感性進行評估并檢測兩組大鼠的糞便性狀及胃腸通過時間，同時行H&E染色評價結(jié)腸粘膜組織學改變;取結(jié)腸組織對目標microRNAs通過qRT-PCR進行驗證。
　　二、腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中miRNA-490-5p對類胰蛋白酶的影響
　　健康wistar大鼠29只，隨機分為4組，分別為正常對照組（正常組）5只、IBS-D組（造模組）8只、慢病毒空載體對照組（空載組）8只、慢病毒mi

4、RNA-490-5p沉默組（沉默組）8只，采用乙酸灌腸加束縛應激的方法制造IBS-D大鼠模型;模型評估方法同方法一;構(gòu)建慢病毒miRNA-490-5p沉默載體和慢病毒空載體，通過大鼠尾靜脈注射慢病毒及空載體，10天后處死大鼠，取結(jié)腸粘膜組織用H&E染色評價結(jié)腸粘膜組織學改變，實時熒光定量PCR檢測慢病毒干預后miRNA-490-5p的表達量，通過免疫組織化學法檢測類胰蛋白酶的表達量。
　　結(jié)果：
　　一、腹瀉型腸易激綜合征大

5、鼠模型中差異表達microRNA的篩選及驗證
　　1.在miRDB數(shù)據(jù)庫共篩選出4個目標microRNA: miR-143-5p、miR-490-5p、miR-204-5p、miR-29b-1-5p。
　　2.IBS-D大鼠的糞便Bristol性狀評級為5-7級，與正常組對比，造模組大便濕重及大便含水量明顯增高，大鼠腹部收縮反射的最小閾值較正常組低，腸道傳輸時間較正常組短，上述指標差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。在0.8

6、ml、1.2mi、1.6ml結(jié)腸容量擴張時，造模組大鼠腹部收縮次數(shù)明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　3.H&E染色結(jié)果顯示:正常組和造模組大鼠的結(jié)腸組織炎癥Kruschewski評分為0-1分，未見明顯炎癥。
　　4.qRT-PCR結(jié)果:與正常組相比，造模組結(jié)腸組織中rno-miR-143-5p、rno-miR-490-5p的表達下降，而rno-miR-143-5p、rno-miR-490-5p的表達

7、量上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　二、腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中miRNA-490-5p對類胰蛋白酶的影響
　　1.大鼠IBS-D模型建模評估指標結(jié)果顯示:正常組大鼠糞便Bristol性狀評級為3-4級，造模組、空載組、沉默組大鼠糞便Bristol性狀評級為5-7級;與正常組相比，其余各組大鼠的糞便含水量明顯增多，糞便腸道通過時間明顯縮短，結(jié)腸擴張腹壁反射最小注水閾值減小(P＜0.05)。
　　2.

8、qRT-PCR結(jié)果顯示:沉默組的miR-490-5p比造模組、正常組及空載組的表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.H&E染色:四組大鼠結(jié)腸組織炎癥Kruschewski評分為0-1分，均無明顯炎癥反應，大鼠造模成功結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)正常。
　　4.免疫組化法結(jié)果顯示:沉默組分別與空載組、造模組、正常組比較，其類胰蛋白酶的表達量均下降，且差異均有顯著性統(tǒng)計學意義(P＜0.05);正常組分別與空載組、造模組

9、比較時，其類胰蛋白酶的表達量下降，且差異均有顯著性統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.IBS-D大鼠模型構(gòu)建成功。
　　2.大鼠體內(nèi)存在4個microRNAs(miR-143-5p、miR-490-5p、miR-204-5p、miR-29b-l-5p)，且在腹瀉型腸易激綜合征中miR-143-5p、miR-490-5p的表達量上調(diào)，miR-204-5p、miR-29b-1-5p表達下調(diào)，提示mircoRN