液相色譜-多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)中一種新的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算方法及其在人肝微粒體藥物代謝酶中的應(yīng)用.pdf

1、在研究細(xì)胞、組織或體液中的蛋白質(zhì)組時，不僅需要對這些蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性分析，更需要對其進(jìn)行定量分析。生物體中蛋白質(zhì)的絕對量以及量的變化對于揭示生物體的生理狀態(tài)及病理狀態(tài)具有重要意義，因此，目標(biāo)蛋白質(zhì)學(xué)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)的一個研究熱點。人肝微粒體中的CYP和UGT酶是藥物進(jìn)行代謝的主要酶類，其表達(dá)水平受到基因多態(tài)性的影響，存在著個體差異性。由于這些藥物代謝酶量的不同對藥物的生物利用度具有很大的影響，因此，對藥物代謝酶含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量不僅在要

2、去研發(fā)，而且在臨床應(yīng)用中具有重要意義。高效液相色譜-同位素稀釋法-多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜（HPLC-SID-MRM MS）方法因其高靈敏度、高選擇性、高準(zhǔn)確性和高通量的特點，加之不需要特異性抗體，已經(jīng)成為藥物代謝酶定量分析的常用方法，可同時對復(fù)雜生物樣本中多個蛋白進(jìn)行定量。但是，這種定量方法應(yīng)用于復(fù)雜生物樣本中多個蛋白定量時，存在空白樣本基體難以制備的問題，文獻(xiàn)中多采用基體緩沖液或外源性基體代替，這會使定量的準(zhǔn)確性變差，因此，實際樣本作為基體的

3、同位素稀釋法可有效解決空白基體的制備問題，但其中內(nèi)源分析物含量的計算一般采用單濃度點計算或不同濃度點計算后取平均值的方法，影響內(nèi)源分析物含量的準(zhǔn)確度，為此，我們提出一種建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方法計算內(nèi)源性分析物，即內(nèi)源性目標(biāo)肽段的計算方法，提高了定量方法的準(zhǔn)確性。將建立的定量方法應(yīng)用于20例人肝微粒體中的21種藥物代謝酶進(jìn)行了含量測定，揭示了正常中國人藥物代謝酶的含量范圍及不同酶之間的相關(guān)性關(guān)系，對藥物研發(fā)和臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義。

4、另外，高效液相色譜分離可降低復(fù)雜生物樣本的復(fù)雜度，有利于提高蛋白定量的準(zhǔn)確度，為此，制備了一種亞2μm反相色譜填料，并對其進(jìn)行了性能評價。
　　本論文共分為四個部分。第一章概述了定量蛋白質(zhì)學(xué)的研究意義及現(xiàn)狀以及高效液相色譜-多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜（SID-MRM MS）方法、內(nèi)標(biāo)肽段制備技術(shù)、人肝微粒體中藥物代謝酶定量方法以及亞2μm反相色譜填料制備技術(shù)的研究進(jìn)展，在此基礎(chǔ)上提出了本論文的研究內(nèi)容和目標(biāo)。
　　在第二章中，提出了在應(yīng)

5、用同位素稀釋結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜(SID-MRMMS)技術(shù)進(jìn)行復(fù)雜生物樣本中蛋白質(zhì)定量中一種新的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算方法，并應(yīng)用于人肝微粒體藥物代謝酶的含量測定。實驗結(jié)果表明與單濃度點計算方法比較，可提高定量的準(zhǔn)確度，即所建方法的回收率為97.0％、定量限LOQ為低于20 fmol、5次測量的變異系數(shù)低于10％、線性范圍為低于20fmol-1000 fmol。進(jìn)一步將此種方法應(yīng)用于5例人肝微粒體樣本中的21種藥物代謝酶含量的測定，測定結(jié)果與文獻(xiàn)報

6、道結(jié)果一致。
　　在第三章中，為了揭示正常中國人CYPs和UGTs的含量范圍及個體差異性，將建立的SID-MRM MS方法對20例正常中國人人肝微粒體中的21種藥物代謝酶進(jìn)行了準(zhǔn)確定量，并且統(tǒng)計分析了不同藥物代謝酶之間的含量相關(guān)性關(guān)系。其中個體差異性最大的藥物代謝酶是CYP3A4、CYP3A5和 UGT1A1;其中CYP3A4的個體差異性達(dá)129倍，CYP3A5的個體差異性達(dá)99倍，UGT1A1的個體差異性達(dá)到170倍;其次CYP

7、1A2、CYP2A6和UGT2B10的個體差異性達(dá)到幾十倍左右。藥物代謝酶表達(dá)水平的兩兩相關(guān)性通過非參數(shù)施佩爾曼秩檢驗(Spearman rank test)進(jìn)行相關(guān)性分析(p=0.01)，分析結(jié)果顯示:CYP1A2、CYP2C8和CYP2C9酶表達(dá)水平具有兩兩正相關(guān)性，UGT1A6、UGT1A9、UGT2B4和UGT2B7酶的表達(dá)水平具有兩兩正相關(guān)性。
　　在第四章中，采用“點擊化學(xué)”的合成方法制備了亞2μm反相色譜填料，F(xiàn)T-