一種南極真菌來源的ETP類化合物HDN-1抗白血病作用與機制研究.pdf

1、急性髓細胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)是一種血液系統(tǒng)惡性克隆性疾病，主要特征為細胞增殖過度和分化受阻。根據(jù)細胞中特殊的基因遺傳學改變及細胞不同分化階段可分為M0～M7八個亞型。其中急性髓細胞部分成熟型白血病和急性早幼粒細胞白血病(APL)分別屬于M2和M3型。
　　目前，對于如何治療白血病患者提高其完全緩解率和無病生存期仍然是研究的熱點。雖然分子靶向治療取得很大進展，但臨床上逐漸出現(xiàn)了耐藥

2、性，并且耐藥機制仍未明確。全反式維甲酸(ATRA)通過誘導(dǎo)APL細胞發(fā)生分化，取得了顯著的治療效果，但治療過程中伴隨著并發(fā)癥的發(fā)生。因此，對于急性髓系白血病治療的探索仍然是一個艱巨的任務(wù)。
　　HDN-1是從南極來源的真菌Oidiodendron truncatum GW3-13中提取獲得的含有硫橋結(jié)構(gòu)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的多硫代二酮哌嗪類(ETPs)化合物。實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)HDN-1能跟熱休克蛋白Hsp90-C端結(jié)合，引起顧

3、客蛋白的降解。在此基礎(chǔ)上，本文系統(tǒng)的評價了HDN-1對腫瘤細胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)HDN-1對急性髓細胞部分成熟型白血病細胞HL-60抑制效果最為顯著，因此，本文進一步在體外細胞水平和體內(nèi)動物水平對HL-60細胞生長抑制的機制進行探討。
　　一、HDN-1誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡
　　1、MTT法檢測HDN-1對多種腫瘤細胞的增殖抑制作用。結(jié)果表明，HDN-1對肝癌，肺癌，乳腺癌等腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值在0.03μm

4、ol·L-1～3μmol·L-1范圍內(nèi)，對白血病細胞HL-60的作用最強，IC50值為38 nmol·L-1。小鼠免疫細胞增殖抑制實驗結(jié)果表明，HDN-1對正常的淋巴免疫細胞沒有生長抑制作用。說明HDN-1在體外具有廣泛的抗腫瘤活性，對HL-60細胞尤為敏感，并且有一定的細胞選擇性，不影響機體免疫細胞活力與T、B細胞的免疫功能。
　　2、Hoechst33342染色發(fā)現(xiàn)HDN-1可以誘導(dǎo)HL-60細胞核固縮、碎裂，出現(xiàn)凋亡小體濃染

5、?；蚪MDNA瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)HDN-1將HL-60細胞的DNA切割成倍于180～200bp大小的DNA片段，表明HDN-1可以誘導(dǎo)HL-60細胞發(fā)生凋亡。采用蛋白印跡法(Western Blotting)對HL-60細胞凋亡的機制進一步探究，結(jié)果顯示，不同濃度的HDN-1作用HL-60細胞24h后，細胞內(nèi)Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、PARP等凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)剪切條帶，Caspase特異性的抑制劑可以恢復(fù)H

6、DN-1抑制的HL-60細胞增殖，恢復(fù)率可達50％～90％。說明HDN-1誘導(dǎo)HL-60細胞發(fā)生依賴Caspase途徑的凋亡。在HDN-1作用的HL-60細胞中，促凋亡蛋白Bax表達量增多，凋亡抑制蛋白Bcl-2、Mcl-1表達減少，DNA斷裂標志性蛋白γ-H2AX表達量增多。說明，HDN-1誘導(dǎo)HL-60細胞發(fā)生凋亡是通過線粒體途徑和死亡受體途徑共同完成的。
　　二、HDN-1誘導(dǎo)HL-60細胞分化
　　1、吉姆薩染色結(jié)果

7、顯示，HDN-1能夠改變HL-60細胞核形態(tài)，降低核質(zhì)比，細胞核逐漸變?yōu)槟I形和分葉核狀。通過過糖原染色(PAS)過碘酸-雪夫氏反應(yīng)檢測細胞內(nèi)糖原變化發(fā)現(xiàn)，HDN-1時間劑量依賴性的增加HL-60細胞內(nèi)PAS陽性率，提示HDN-1可以誘導(dǎo)HL-60細胞發(fā)生分化。
　　2、流式細胞技術(shù)檢測細胞表面特異性抗原的表達發(fā)現(xiàn)，HDN-1可以誘導(dǎo)粒細胞表面抗原CD11b和髓系白血病特異標志抗原CD13的表達量增高，呈CD13hi/CD11b+的

8、變化趨勢，而單核細胞特異抗原CD14未發(fā)生明顯變化，說明HDN-1誘導(dǎo)HL-60細胞發(fā)生分化是向著成熟粒細胞方向進行的。
　　3、通過吉姆薩染色和PAS染色比較了HDN-1與全反式維甲酸(ATRA)對HL-60細胞的分化誘導(dǎo)作用。染色和統(tǒng)計結(jié)果表明，HDN-1可以在更短的時間，更低的濃度下誘導(dǎo)HL-60細胞發(fā)生分化。說明，HDN-1比ATRA在誘導(dǎo)HL-60細胞分化方面更有優(yōu)勢。
　　4、聯(lián)合HDN-1與ATRA共同作用于H

9、L-60細胞，聯(lián)合指數(shù)CI=0.51＜1，等效線圖解法分析結(jié)果表明，兩種化合物聯(lián)用的多個IC50值均位于等效線的左下方，說明HDN-1與ATRA聯(lián)合對HL-60細胞的增殖抑制是協(xié)同作用。
　　三、HDN-1的體內(nèi)藥效學研究
　　本部分實驗成功建立了急性髓細胞白血病部分成熟型細胞HL-60的NOD-SCID小鼠皮下異種植瘤模型，并通過預(yù)實驗設(shè)計方案，設(shè)置空白組、溶劑組、HDN-1高、低劑量組(1mg/kg，0.5mg/kg)，

10、靜脈注射，連續(xù)給藥12天。實驗結(jié)果顯示HDN-1高、低兩個劑量的抑瘤率分別是18％和46％，說明HDN-1可以抑制HL-60移植瘤的生長，且對小鼠體重的影響較小。
　　四、HDN-1對HL-60細胞誘導(dǎo)分化和凋亡的機制研究
　　(1) Hsp90發(fā)揮分子伴侶作用需要輔分子伴侶的存在，Hsp70是Hsp90重要的共分子伴侶之一，Hsp70能與Hsp90-C端結(jié)合，形成蛋白修飾復(fù)合體，行使Hsp90分子伴侶的功能。本部分實驗通過

11、免疫共沉淀方法考察了HDN-1對HL-60細胞內(nèi)Hsp90與Hsp70的結(jié)合情況，證實HDN-1可以抑制Hsp90與Hsp70的結(jié)合，說明HDN-1在白血病細胞中仍然與Hsp90-C端相結(jié)合，抑制Hsp90加工顧客蛋白的功能。
　　(2)存在于白血病中的Hsp90顧客蛋白很多，為進一步考察HDN-1抗白血病的機制，通過Western Blot方法檢測了白血病細胞中與細胞凋亡分化相關(guān)的Hsp90顧客蛋白的表達，結(jié)果表明HDN-1引起

12、了細胞中Akt、p-Akt、Erk、p-Erk、CyclinD1、Bcr-Abl、Stat3、p-Stat3等蛋白的降解和活性抑制，從而使得下游信號分子發(fā)生改變，提示這可能是HDN-1誘導(dǎo)白血病細胞發(fā)生凋亡和分化的機制。
　　綜上所述，HDN-1具有廣譜的抗腫瘤活性，對于急性髓性白血病細胞HL-60作用尤為敏感，HDN-1與ATRA聯(lián)用對HL-60細胞的生長增殖作用更強，兩種化合物表現(xiàn)為協(xié)同作用。HDN-1可以誘導(dǎo)HL-60細胞發(fā)

13、生凋亡和成熟粒細胞方向的分化，這是首次發(fā)現(xiàn)ETP類化合物能夠誘導(dǎo)白血病細胞分化，并且與ATRA進行比較發(fā)現(xiàn)，HDN-1能夠在更短的時間更低的濃度下誘導(dǎo)HL-60細胞分化。HDN-1在動物體內(nèi)可以顯著抑制小鼠HL-60白血病皮下移植瘤的生長，而HDN-1對于白血病的抑制可能是通過與Hsp90相結(jié)合抑制Hsp90顧客蛋白中與分化凋亡相關(guān)的蛋白的表達實現(xiàn)的。這為今后進一步研究HDN-1的抗白血病機制提供了有效的數(shù)據(jù)依據(jù)，為ETP類化合物的成藥