Ets2對食管鱗癌細胞生長、侵襲及mTOR-p70S6K分子信號的調(diào)控作用.pdf

1、食管癌又被稱之為食道癌，是食管腺以及食管粘膜的惡性上皮性腫瘤，臨床主要有食管腺癌和食管鱗癌兩種類型，而二者的病理轉(zhuǎn)歸及發(fā)病機制不同。食管癌的死亡率和發(fā)病率在全世界惡性腫瘤排行中分別居于第8位和第9位。食管癌呈地域性分布，西方國家以腺癌為主；在亞洲地區(qū)以鱗狀細胞癌為主。我國食管鱗癌高發(fā)地在華北太行山脈附近，其中河南省林州市發(fā)病率最高。雖然食管癌方面的臨床和基礎(chǔ)研究已經(jīng)持續(xù)了很多年，但其發(fā)病的原因尚不完全清楚。
　　傳統(tǒng)的治療方法主要

2、有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)療法?；颊咴谑彻馨┌l(fā)病早期臨床癥狀和體征無特異性，也沒有特異性的腫瘤分子標(biāo)志物，癥狀明顯時多數(shù)病人已是腫瘤的中晚期，出現(xiàn)周圍組織浸潤或遠端轉(zhuǎn)移，失去了最佳治療時機，這類患者5年的生存率小于10％。所以，尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療干預(yù)的生物靶點及其作用的分子機制十分重要。
　　Ets2為Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，能夠調(diào)控許多下游靶基因，通過蛋白之間的相互作用或者信號通路參與調(diào)節(jié)細胞的凋亡、分化、增殖、轉(zhuǎn)移

3、以及血管生成、器官發(fā)生等。Ets2在各種細胞和組織中均有表達，但是在不同的細胞和組織中其表達量和功能也具有差異性。研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤中均發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Ets2存在表達異常的現(xiàn)象，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子Ets2可能成為腫瘤的一個潛在癌癥診斷的標(biāo)志物和治療靶點。然而，目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子Ets2對食管鱗癌細胞的影響報道較少，僅有研究顯示轉(zhuǎn)錄因子Ets2在食管鱗癌組織中表達上調(diào)。因此深入研究轉(zhuǎn)錄因子 Ets2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作

4、用機制，能夠為研究食管鱗癌的發(fā)生機制及生物治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　本課題以轉(zhuǎn)錄因子Ets2為研究對象，檢測其在正常食管上皮細胞和不同食管鱗癌細胞株中的蛋白水平表達差異，并采用RNA干擾技術(shù)靶向沉默Ets2基因，研究Ets2表達下降對食管鱗癌細胞生物學(xué)行為的影響，初步探討Ets2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　本課題主要分為兩部分：
　　第一部分：檢測轉(zhuǎn)錄因子Ets2在食管鱗癌細胞株EC1、Eca109、EC

5、9706中的蛋白表達情況。
　　第二部分：研究轉(zhuǎn)錄因子Ets2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用。通過靶向特異性的siRNA阻斷Ets2基因表達，檢測Ets2表達下調(diào)對食管鱗癌細胞株增殖、侵襲、周期和凋亡的影響，并檢測mTOR-p70S6K信號通路主要蛋白的表達情況，初步研究Ets2基因在食管鱗癌細胞中的生物學(xué)效應(yīng)及作用機制。
　　方法：
　　1.食管鱗癌細胞中轉(zhuǎn)錄因子Ets2的表達情況
　　利用Western blot

6、技術(shù)從蛋白水平檢測轉(zhuǎn)錄因子Ets2在正常食管上皮細胞Het-1A和食管鱗癌細胞株EC1、Eca109、EC9706中的表達。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子Ets2對食管鱗癌調(diào)控作用的初步探索
　　體外化學(xué)合成3對針對Ets2基因mRNA的特異性siRNA，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞株，通過Real-time PCR和Western blot篩選效率最高的siRNA片段。利用篩選到的siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞，以轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的

7、細胞、未轉(zhuǎn)染siRNA的細胞及只加入了轉(zhuǎn)染試劑的細胞作為對照，采用EdU熒光標(biāo)記法和 CCK-8法檢測食管鱗癌細胞增殖率和細胞存活率的變化；利用AnnexinV-FITC/PI雙染法及 caspase-3的蛋白水平表達情況分析細胞凋亡的變化；流式細胞儀檢測食管鱗癌細胞周期的變化；Transwell小室法檢測食管鱗癌細胞侵襲能力的變化，Western blot檢測E-cadherin的表達情況來反應(yīng)食管鱗癌細胞粘附能力的變化；通過West

8、ern blot檢測mTOR/p70S6K途徑主要蛋白的表達水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.食管鱗癌細胞中轉(zhuǎn)錄因子Ets2的表達情況
　　Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子Ets2在正常食管上皮細胞和食管鱗癌細胞株中均有表達，與正常食管上皮細胞Het-1A相比，Ets2在食管鱗癌細胞EC1、Eca109和EC9706中的蛋白表達量均明顯升高，尤其在EC9706細胞中增加最為顯著，因此采用EC9706細胞篩選si

9、RNA干擾片段。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子Ets2對食管鱗癌調(diào)控作用的初步探索
　　3對Ets2基因的特異性siRNA干擾片段中，Ets2 siRNA1在轉(zhuǎn)染48h后，轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的沉默效果相對較好，因此選用Ets2 siRNA1片段轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞系EC1、Eca109、EC9706進行后續(xù)實驗。與對照組相比，靶向siRNA下調(diào)Ets2基因表達后，可以明顯地抑制食管鱗癌細胞的增殖；Ets2 siRNA組的食管鱗癌細胞的早期凋

10、亡比例上升，凋亡蛋白caspase-3的蛋白水平表達增多，說明下調(diào)Ets2基因能夠促進細胞凋亡；Ets2表達下調(diào)的食管鱗癌細胞Eca109、EC1的G0/G1期細胞明顯增加；減弱食管鱗癌細胞侵襲能力，且E-cadherin的蛋白表達上升說明食管鱗癌細胞的粘附能力增強；此外，Western blot檢測顯示Ets2 siRNA組mTOR/p70S6K信號通路中的關(guān)鍵蛋白p-mTOR和p-p70S6K的表達量明顯下降。
　　結(jié)論：

11、r>　　1.轉(zhuǎn)錄因子Ets2在三株食管鱗癌細胞中均呈高表達；
　　2.靶向siRNA下調(diào)Ets2表達后，食管鱗癌細胞的增殖能力減弱，促進細胞凋亡，細胞周期被阻滯在G0/G1期，細胞的侵襲能力減弱，說明轉(zhuǎn)錄因子Ets2表達下調(diào)能夠有效抑制食管鱗癌細胞生長和侵襲；
　　3. Ets2表達下調(diào)的食管鱗癌細胞株中，mTOR/p70S6K中關(guān)鍵因子表達量明顯下調(diào)，初步推測 Ets2可能通過 mTOR/p70S6K信號通路在食管鱗癌發(fā)生