吉西他濱與AMD3100聯(lián)合應(yīng)用于膽管癌RBE細(xì)胞株對(duì)CXCR4-CXCL12軸的作用.pdf

1、目的:AMD3100是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)受體CXCR4的非肽類阻斷劑，它能特異性與CXCR4結(jié)合，阻斷SDF-1/CXCR4軸參與的生理過(guò)程，并快速有效動(dòng)員骨髓造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前發(fā)現(xiàn)，AMD3100能夠通過(guò)將某些腫瘤細(xì)胞動(dòng)員到周圍循環(huán)中，破壞腫瘤賴以生長(zhǎng)的微環(huán)境，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒藥物的敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　上述發(fā)現(xiàn)均為AMD3100應(yīng)用于CXCR4高表達(dá)的腫瘤治

2、療方面提供了一種新的思路，使其作為細(xì)胞毒藥物的輔助劑或者增強(qiáng)劑應(yīng)用于腫瘤治療。當(dāng)前AMD3100應(yīng)用于腫瘤治療日益受到關(guān)注，越來(lái)越多的專家醫(yī)者將AMD3100與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用，以達(dá)到更有效治療腫瘤的作用。
　　膽管癌作為惡性腫瘤的一種，其細(xì)胞中過(guò)高表達(dá)CXCR4。研究表明正常膽管中沒(méi)有CXCL12和CXCR4蛋白的表達(dá)，但是在膽管癌中，CXCL12和CXCR4蛋白的表達(dá)分別為88％和53％，有轉(zhuǎn)移的膽管癌中CXCR4蛋白的表達(dá)更

3、高，為94％，明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移的膽管癌細(xì)胞，所以可將CXCR4作為判斷膽管癌惡性程度高低及預(yù)后的指標(biāo)之一，并且利用CXCR4的阻斷劑AMD3100治療膽管癌在理論上具有一定的效果。但是，目前膽管癌的臨床療效較差，關(guān)于AMD3100治療膽管癌的效果也未見(jiàn)報(bào)道。
　　因此，在前期研究的的基礎(chǔ)上，我們將AMD3100聯(lián)合吉西他濱，檢測(cè)不同濃度時(shí)對(duì)膽管癌細(xì)胞株RBE增殖能力和侵襲能力的影響，不同濃度時(shí)對(duì)CXCR4的影響等。通過(guò)分析二者關(guān)系，

4、探討AMD3100對(duì)膽管癌的治療效果，為AMD3100能否成為臨床治療膽管癌的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、通過(guò)MTT方法檢測(cè)不同濃度的吉西他濱處理膽管癌RBE細(xì)胞株24h后細(xì)胞生存率變化，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCR4基因激動(dòng)或阻斷以及聯(lián)合化療藥物吉西他濱后對(duì)膽管癌RBE細(xì)胞增殖的影響。
　　將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膽管癌RBE細(xì)胞消化成單細(xì)胞混勻，取適量細(xì)胞放入含吉西他濱終濃度分別為0、0.1、1、10mg/ml的培養(yǎng)基

5、中培養(yǎng)24h，利用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率;將吉西他濱按照0、0.625、1.25、2.5、5、10um給藥濃度進(jìn)行MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　2、通過(guò)transwell方法觀察各不同濃度的吉西他濱對(duì)膽管癌RBE細(xì)胞侵襲性的變化，同時(shí)檢測(cè)AMD3100聯(lián)合吉西他濱對(duì)細(xì)胞侵襲性的變化。
　　將含有吉西他濱終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5、5、10um的無(wú)血清培養(yǎng)基500ul分別加入24孔板中，置于37℃、5％C

6、O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再進(jìn)行福爾馬林固定、結(jié)晶紫染色，晾干后放于倒置顯微鏡下觀察。
　　3、通過(guò)Western-blot檢測(cè)CXCR4的表達(dá)變化。CXCR4受體阻斷劑AMD3100及聯(lián)合吉西他濱對(duì)CXCR4 VEGF-C、N型鈣粘素MMP-9的表達(dá)變化。
　　將膽管癌RBE細(xì)胞進(jìn)行濃度為0、0.625、1.25、2.5、5、10um的吉西他濱處理，提取細(xì)胞全蛋白，用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，再用SDS-PAGE分離蛋白，最后

7、用免疫印跡(West-blot)進(jìn)行分析。
　　4、采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)膽管癌細(xì)胞CXCR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)VEGF-C、N型鈣粘素MMP-9等侵襲相關(guān)因子mRNA的轉(zhuǎn)錄變化。
　　結(jié)果:
　　1、MTT法檢測(cè)吉西他濱、AMD3100、SDF-1α以及聯(lián)合用藥組對(duì)膽管癌RBE細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　MTT法檢測(cè)結(jié)果為，藥物作用24h后，在吉西他濱濃度為0.33、3.33、33.33uM時(shí)，細(xì)胞生存率分別為

8、:76.65％、71.40％、52.25％;給予AMD3100濃度分別為:10、100、1000ng/ml時(shí)，細(xì)胞生存率分別為:103.41％、96.05％、106.20％; SDF-1α濃度:10、100、1000ng/ml時(shí)，細(xì)胞生存率分別為:107.12％、99.05％、107.00％，給予不同濃度AMD3100及SDF-1α，細(xì)胞生存率未有明顯的差異(P＞0.05)。吉西他濱、AMD3100、SDF-1α聯(lián)合用藥組也未見(jiàn)明顯差異

9、。
　　綜上結(jié)果表明，吉西他濱能夠明顯促進(jìn)膽管癌RBE細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴性，隨著吉西他濱濃度的升高細(xì)胞生存率逐漸降低。
　　2、Transwell法觀察各用藥組對(duì)膽管癌RBE細(xì)胞的侵襲性的變化。
　　細(xì)胞接種于Transwell上室內(nèi)，培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果為:吉西他濱組下層細(xì)胞數(shù)目明顯多于空白組、AMD3100組以及吉西他濱與AMD3100聯(lián)合用藥組，空白組與AMD3100單藥組差異性不明顯，聯(lián)合組介于之間。

10、r>　　3、Western-blot法檢測(cè)應(yīng)用吉西他濱、AMD3100以及聯(lián)合用藥組對(duì)CXCR4及侵襲相關(guān)因子N-cadherin、VEGF-C、MMP-9蛋白表達(dá)差異。
　　Western-blot結(jié)果顯示:將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的膽管癌RBE細(xì)胞給予藥物作用后48h收集，提取總蛋白檢測(cè)。先前實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL-12在膽管癌細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)。給予吉西他濱濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20uM時(shí)，細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)水平升高?？?/p>

11、白組、AMD3100組、吉西他濱組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞培養(yǎng)48h后收集蛋白檢測(cè)，吉西他濱組CXCR4、N-cadherin、VEGF-C、MMP-9蛋白表達(dá)升高，聯(lián)合AMD3100后相關(guān)蛋白表達(dá)量有所下降，介于吉西他濱和AMD3100單獨(dú)用藥組。差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　綜上結(jié)果表明，吉西他濱能夠影響CXCR4蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性，隨著用藥濃度的增加，表達(dá)水平升高，還使N-cadherin、VEGF-C、MMP-

12、9蛋白等均表達(dá)升高。
　　4、Real-time PCR法檢測(cè)空白組、應(yīng)用吉西他濱、AMD3100以及聯(lián)合用藥組對(duì)CXCR4及侵襲相關(guān)因子N-cadherin、VEGF-C、MMP-9 mRNA表達(dá)差異。
　　Real-time PCR結(jié)果顯示:將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的膽管癌RBE細(xì)胞給予藥物作用后48h收集，提取總RNA檢測(cè)。空白組未檢測(cè)到CXCL-12 mRNA的表達(dá)。用藥濃度及分組同上述Western-blot，檢測(cè)CXCR4及

13、N-cadherin、VEGF-C、MMP-9 mRNA表達(dá)，結(jié)果及趨勢(shì)同蛋白表達(dá)水平一致。差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　綜上結(jié)果表明，吉西他濱能夠影響CXCL-12 mRNA的表達(dá)，且呈劑量依賴性，隨著用藥濃度的增加，表達(dá)水平升高，并且使CXCR4及N-cadherin、VEGF-C、MMP-9 mRNA等表達(dá)均升高。
　　結(jié)論:
　　1、吉西他濱能夠顯著抑制膽管癌RBE細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴性，隨著給

14、藥濃度的升高細(xì)胞生存率逐漸降低。其對(duì)細(xì)胞的侵襲性也具有一定的促進(jìn)作用。
　　2、CXCR4/CXCL12對(duì)膽管癌細(xì)胞的增殖作用無(wú)影響。
　　3、吉西他濱能夠影響CXCR4蛋白和CXCL-12 mRNA的表達(dá)，且均呈劑量依賴性，隨著用藥濃度的增加，表達(dá)水平升高，并使N-cadherin、VEGF-C、MMP-9蛋白及其mRNA表達(dá)升高。
　　4、CXCR4的受體阻斷劑AMD3100能夠抑制吉西他濱對(duì)膽管癌細(xì)胞侵襲性的促進(jìn)