酸橙和甜橙枳術(shù)丸化學(xué)成分與胃腸功能對(duì)比研究.pdf

1、枳術(shù)丸是治療中醫(yī)“痞滿”的傳統(tǒng)名方。自金代張?jiān)貏?chuàng)制以來(lái)，枳術(shù)丸在中醫(yī)臨床多用于治療脾胃損傷日久而生的慢性及虛損性疾病。枳術(shù)丸由炒枳實(shí)和麩炒白術(shù)組成，枳實(shí)有酸橙和甜橙兩種，分別為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。臨床研究表明，酸橙枳實(shí)配制的枳術(shù)丸治療功能性消化不良脾虛氣滯證的療效顯著優(yōu)于甜橙枳實(shí)配制的枳術(shù)丸。因此，本研究一方面從物質(zhì)基礎(chǔ)角度，對(duì)比分

2、析兩種枳術(shù)丸化學(xué)組成及含量差異，另一方面從藥效學(xué)角度，對(duì)比研究?jī)煞N枳術(shù)丸及不同組分對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)及胃腸激素分泌的影響，以探討兩種枳術(shù)丸成分差異與功效差異的關(guān)系，從而為制訂枳術(shù)丸質(zhì)量評(píng)價(jià)方法和臨床合理用藥提供科學(xué)基礎(chǔ)。
　　1、兩種枳術(shù)丸主要有效組分提取工藝研究
　　1.1揮發(fā)油最佳提取工藝研究
　　以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，以粉碎度、浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間為考察因素，確定麩炒白術(shù)揮發(fā)油的最佳提取工藝為:加入飲片6倍量水，浸泡

3、2h，水蒸汽蒸餾法提取10h。依據(jù)課題組之前確定的枳實(shí)揮發(fā)油提取工藝，即枳實(shí)飲片加入6倍量水，浸泡2h，水蒸汽蒸餾法提取8h，分別提取得到兩種炒枳實(shí)揮發(fā)油。
　　1.2提取方式對(duì)枳術(shù)丸揮發(fā)油組成成分與含量的影響
　　依據(jù)揮發(fā)油不穩(wěn)定的性質(zhì)，采用GC-MS法和HPLC方法，對(duì)比研究了常規(guī)的揮發(fā)油提取方法（見光提?。?，與揮發(fā)油提取器用黑布包裹的提取方法（避光提?。?，得到的揮發(fā)油組成成分和含量是否存在差異。結(jié)果顯示，避光與見光的枳

4、術(shù)丸揮發(fā)油得率沒(méi)有顯著差異。
　　GC-MS分析結(jié)果顯示，避光與見光的枳術(shù)丸揮發(fā)油分別鑒定了54個(gè)和60個(gè)成分，成分類型有萜烯類，還有醇類、酸類、酯類等，共8類成分，但每種類型成分的個(gè)數(shù)及相對(duì)含量存在差異。兩種枳術(shù)丸揮發(fā)油共有成分46個(gè)，其中含量最高的成分都是來(lái)源于枳實(shí)的檸檬烯。見光揮發(fā)油較避光揮發(fā)油相比，增加了13個(gè)成分，消失了8個(gè)成分。同時(shí)與麩炒白術(shù)、炒枳實(shí)揮發(fā)油進(jìn)行對(duì)比，確定枳術(shù)丸揮發(fā)油化學(xué)成分來(lái)源。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與避光揮發(fā)油比

5、較，見光的枳術(shù)丸揮發(fā)油成分差異主要來(lái)自炒白術(shù)中成分蒼術(shù)酮、β-桉葉醇、異絨白乳菇醛、白術(shù)內(nèi)酯類等成分的變化。
　　HPLC對(duì)比分析4種主要活性成分蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ的含量變化。結(jié)果表明，見光提取的枳術(shù)丸揮發(fā)油中蒼術(shù)酮含量較避光提取顯著降低，分別為73.01 mg/g和100.3 mg/g，而白術(shù)內(nèi)酯-Ⅰ顯著升高，分別為0.7572 mg/g和0.3541 mg/g，白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ顯著升高，分別為0.41

6、24 mg/g和0.3219 mg/g，白術(shù)內(nèi)酯-Ⅱ差異不明顯，分別為2.026 mg/g和2.158 mg/g。
　　結(jié)果提示，應(yīng)關(guān)注實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能引起的成分變化。
　　1.3枳術(shù)丸揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合及其穩(wěn)定性研究
　　鑒于枳術(shù)丸揮發(fā)油的不穩(wěn)定性質(zhì)，為保證藥效實(shí)驗(yàn)樣品的穩(wěn)定性，采用β-環(huán)糊精對(duì)枳術(shù)丸揮發(fā)油進(jìn)行包合，并通過(guò)HPLC法測(cè)定揮發(fā)油中主要不穩(wěn)定成分蒼術(shù)酮及白術(shù)內(nèi)酯-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ含量隨時(shí)間變化，對(duì)比包合與不包

7、合枳術(shù)丸揮發(fā)油穩(wěn)定性。結(jié)果表明，揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合后，其中的蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ在保存4周內(nèi)含量穩(wěn)定，變幅較小，保存至第4周時(shí)的含量變化率分別為-4％、+5％、+3％和+5％;而未包合揮發(fā)油4種成分含量變化幅度較大，保存至第4周時(shí)，含量變化百分率分別為-71％、+19％、-4％和-9％。
　　1.4麩炒白術(shù)飲片主要有效成分含量測(cè)定方法研究
　　采用HPLC方法，建立了麩炒白術(shù)飲片中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)

8、酯-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ含量測(cè)定方法。色譜條件:Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱。水-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫:0～22 min，56％～70％乙腈;20～30 min，70％～90％乙腈;30～35 min，90％～100％乙腈。檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，275 nm，流速為1 mL/min，柱溫30℃。方法學(xué)考察結(jié)果顯示上述方法穩(wěn)定可靠，可以作為麩炒白術(shù)中蒼術(shù)酮及主要內(nèi)酯類成分的含量測(cè)定方法。
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9、.5麩炒白術(shù)主要有效成分乙醇提取最佳工藝研究
　　為了進(jìn)一步提取有效成分，以蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ含量為指標(biāo)，以乙醇濃度、乙醇用量和提取時(shí)間為考察因素，通過(guò)L9(34)正交表以及線型比例標(biāo)準(zhǔn)化、多指標(biāo)綜合評(píng)分法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定了從麩炒白術(shù)提取揮發(fā)油后藥渣中提取三種白術(shù)內(nèi)酯類成分及蒼術(shù)酮最佳工藝條件。最佳提取工藝為:采用8倍量95％乙醇，提取2次，每次1.5 h。
　　1.6兩種炒枳實(shí)乙醇組分、黃酮

10、及生物堿組分提取分離
　　為了確定兩種枳術(shù)丸功效差異的化學(xué)來(lái)源，采取我們課題組前期確定的方法，分別分離兩種炒枳實(shí)乙醇組分、黃酮組分及生物堿組分。結(jié)果顯示，炒酸橙枳實(shí)乙醇組分、黃酮組分及生物堿組分得率分別為53.00％、18.16％、11.48％;炒甜橙枳實(shí)乙醇組分、黃酮組分及生物堿組分得率分別為50.70％、15.47％、13.61％。酸橙黃酮組分主要有4種黃酮類成分，分別是蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷，而甜橙黃酮組分主要

11、有2種黃酮類成分，分別是蕓香柚皮苷和橙皮苷。兩種炒枳實(shí)生物堿成分辛弗林含量無(wú)顯著性差異。
　　2、兩種枳術(shù)丸化學(xué)成分組成和含量對(duì)比研究
　　2.1兩種枳術(shù)丸揮發(fā)油GC-MS對(duì)比分析
　　采用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)避光提取的酸橙枳術(shù)丸與甜橙枳術(shù)丸揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比分析，并以峰面積為基礎(chǔ)重新匹配公式計(jì)算后的方法進(jìn)行含量對(duì)比分析。結(jié)果表明，酸橙、甜橙枳術(shù)丸揮發(fā)油分別鑒定了57個(gè)和54個(gè)化學(xué)成分，分別占色譜峰總數(shù)的91

12、.00％和92.05％，占揮發(fā)油總量的96.02％和95.30％。兩種揮發(fā)油共有的化學(xué)成分51個(gè)，且各成分相對(duì)含量有一定差異。酸橙枳術(shù)丸揮發(fā)油獨(dú)有成分，共計(jì)5個(gè)，甜橙枳實(shí)配制的枳術(shù)丸揮發(fā)油獨(dú)有成分，共計(jì)3個(gè)。此外，經(jīng)與單味藥材揮發(fā)油對(duì)比分析，甜橙枳實(shí)揮發(fā)油與麩炒白術(shù)揮發(fā)油共有成分5個(gè)。以峰面積為基礎(chǔ)，并通過(guò)百分化轉(zhuǎn)化，更直觀地反映出兩種枳術(shù)丸揮發(fā)油各成分含量存在明顯差異。
　　2.2雙波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定兩種枳術(shù)丸8種主要有效成分含量的方

13、法研究
　　采用HPLC法，建立了多波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定兩種枳術(shù)丸8種主要有效成分含量的方法。色譜條件:Agilent XDB-C18(4.6 mm×100 mm，1.8μm)色譜柱;流動(dòng)相:0.01％磷酸二氫鈉水溶液(A)-乙腈(B):0～5 min，5％ B;5～7 min，5～10％ B;7～10 min,10～16％ B;10～25 min,16～18％ B;25～42 min,18～35％ B;42～55 min,35～58％

14、B;55～65 min,58％ B;65～75 min,58～100％ B;75～85 min,100％ B。柱溫:30℃。流速:1 ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng):283 nm（0-52 min，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷，白術(shù)內(nèi)酯-Ⅰ）;220 nm（52-65 min，白術(shù)內(nèi)酯-Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ、蒼術(shù)酮）。方法學(xué)結(jié)果表明該方法穩(wěn)定可靠，可以作為兩種枳術(shù)丸中主要黃酮類成分、內(nèi)酯類成分及主要揮發(fā)性成分蒼術(shù)酮含量測(cè)定方法。結(jié)果表明，酸

15、橙枳術(shù)丸中均檢測(cè)到8種成分，而甜橙枳術(shù)丸中沒(méi)有檢測(cè)到柚皮苷與新橙皮苷2種黃酮類成分。
　　3、兩種枳術(shù)丸及不同組分對(duì)小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)的影響
　　3.1對(duì)正常小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)的影響
　　采用酚紅含量測(cè)定方法，考察了酸橙枳術(shù)丸和甜橙枳術(shù)丸全方、兩種枳實(shí)黃酮組分、生物堿組分及揮發(fā)油組分（各組分均加入白術(shù)揮發(fā)油和乙醇提取物）對(duì)正常小鼠胃排空以及小腸推進(jìn)的影響。結(jié)果顯示，酸橙枳術(shù)丸全方組、陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組動(dòng)物之間胃排空率及小腸推進(jìn)

16、率無(wú)顯著性差異，其它各給藥組均顯示出一定抑制正常小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)的作用。
　　3.2對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)抑制小鼠的影響
　　采用酚紅含量測(cè)定方法，考察了酸橙枳術(shù)丸全方和甜橙枳術(shù)丸全方、兩種枳實(shí)黃酮組分、生物堿組分及揮發(fā)油組分（各組分均加入白術(shù)揮發(fā)油和乙醇提取物）對(duì)阿托品致胃腸運(yùn)動(dòng)抑制模型小鼠胃排空以及小腸推進(jìn)的影響。各結(jié)果顯示，兩種枳術(shù)丸全方及各組分組藥物均顯示出不同程度改善模型小鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)抑制的作用。酸橙枳術(shù)丸全方組作用顯著優(yōu)于甜橙枳

17、術(shù)丸全方組，且與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差異;酸橙生物堿組分組與甜橙生物堿組分組相比，對(duì)小腸推進(jìn)的促進(jìn)作用無(wú)顯著性差異，在促進(jìn)胃排空作用方面，前者顯著優(yōu)于后者;酸橙黃酮組分在促進(jìn)胃排空及小腸推進(jìn)作用方面，均優(yōu)于甜橙黃酮組分;兩種枳實(shí)揮發(fā)油組分在保持與原方劑量一致時(shí)，促胃腸運(yùn)動(dòng)作用較弱，但加大劑量后，藥效作用顯著提高;兩種枳術(shù)丸全方在改善模型小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)方面，均優(yōu)于各自黃酮組分、生物堿組分及揮發(fā)油組分。
　　結(jié)果表明，兩種枳術(shù)丸全方、黃酮

18、及揮發(fā)油組分藥效存在明顯差異。
　　4、兩種枳術(shù)丸及酸橙枳術(shù)丸不同組分對(duì)FD大鼠的影響
　　采用酚紅含量測(cè)定法與放免法分別考察了兩種枳術(shù)丸全方及酸橙黃酮組分、生物堿組分組對(duì)復(fù)合病因功能性消化不良(FD)大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)障礙與胃腸激素水平的作用。結(jié)果顯示，各給藥組均可提高FD模型大鼠胃排空率與小腸推進(jìn)率，酸橙枳術(shù)丸全方組治療FD大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)抑制的效果要顯著優(yōu)于甜橙枳術(shù)丸全方組;酸橙枳術(shù)丸全方組與酸橙黃酮、生物堿組相比，在改善FD模

19、型大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)方面，顯著優(yōu)于后兩者。各給藥組均可提高FD模型大鼠血清GAS、血漿MTL水平，并且降低血漿VIP水平，酸橙枳術(shù)丸全方組動(dòng)物3種胃腸激素水平與空白對(duì)照組動(dòng)物均無(wú)顯著性差異;酸枳術(shù)丸全方組在改善3種胃腸激素水平方面，均優(yōu)于甜橙枳術(shù)丸全方組;在降低FD大鼠血漿VIP水平方面，酸橙枳術(shù)丸全方、黃酮組分、生物堿組分組與陽(yáng)性對(duì)照組之間均無(wú)無(wú)顯著性差異;酸橙枳術(shù)丸全方組在提高血清GAS、血漿MTL水平方面，明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組及酸橙黃酮組

20、分組;在提高血漿MTL水平方面，酸橙生物堿組分組與酸橙枳術(shù)丸全方組無(wú)顯著性差異，但血漿GAS水平明顯低于酸橙枳術(shù)丸全方組。
　　5、結(jié)論
　　本文研究了兩種枳術(shù)丸不同成分差異及對(duì)應(yīng)藥效的關(guān)系，初步結(jié)果顯示兩種枳術(shù)丸化學(xué)組成明顯不同，黃酮組分與揮發(fā)油組分存在顯著差異。此外，藥效結(jié)果顯示，兩種枳術(shù)丸全方及不同組分藥效作用存在一定的差異。
　　甜橙枳術(shù)丸全方、黃酮組分與酸橙枳術(shù)丸全方、黃酮組分相比，缺少了新橙皮苷和柚皮苷，可