EDF的清除自由基活性和對(duì)大腸桿菌的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　EDF是2007年在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種群體感應(yīng)信號(hào)分子，為一個(gè)線(xiàn)性的五肽，其氨基酸序列為NNWNN。報(bào)道認(rèn)為EDF參與mazEF介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡途徑。然而，EDF在細(xì)胞間的傳遞方式和“信號(hào)通路”尚不明確。本論文將研究EDF可能的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，以及EDF對(duì)大腸桿菌存活的影響。
　　方法:
　　1、用Amp處理大腸桿菌，得到裂解液，通過(guò)親和柱層析和SDS-PAGE電泳得到與EDF親和的主要條帶，經(jīng)串

2、聯(lián)質(zhì)譜鑒定和 Mascot檢索對(duì)比鑒定與 EDF親和的蛋白。
　　2、SDS法提取OmpC并純化；Ni-螯合親和色譜純化出N-端融合了His-tag的重組GS；構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法誘導(dǎo)表達(dá)GDH，用His TrapHP鎳柱純化GDH；驗(yàn)證EDF及其突變體對(duì)GS的作用，驗(yàn)證EDF對(duì)GDH的作用。
　　3、合成 EDF及其一系列丙氨酸和甘氨酸替換的類(lèi)似物，檢測(cè)了 EDF對(duì)DPPH、超氧自由基和羥自由基的清除作用。
　　4、驗(yàn)

3、證EDF抵御羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA損傷的作用。
　　5、驗(yàn)證EDF與Amp聯(lián)用時(shí)的殺菌效果。
　　結(jié)果:
　　1、我們將質(zhì)譜檢測(cè)得到的多肽片段指紋圖譜在線(xiàn)檢索，與大腸桿菌的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，EDF能夠與大腸桿菌的外膜孔蛋白（OmpC）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脫氫酶（GDH）結(jié)合。
　　2、EDF及其不同的突變體均對(duì)GS的活力有不同程度的抑制作用，對(duì)GDH則沒(méi)有作用。
　　3、

4、EDF不能清除DPPH自由基，能夠清除超氧自由基和羥自由基，尤其是對(duì)于羥自由基的清除作用非常顯著。
　　4、EDF能夠保護(hù)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA免受羥自由基的破壞。
　　5、EDF與抗生素聯(lián)用會(huì)抑制抗生素氨芐青霉素（Amp）的抗菌作用。
　　結(jié)論:
　　1、EDF可能是通過(guò)OmpC進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的。
　　2、EDF可以通過(guò)抑制 GS的活性來(lái)影響大腸桿菌對(duì)氮源的使用，從而行使其信號(hào)分子的作用，導(dǎo)致細(xì)菌的細(xì)胞

5、程序性死亡。
　　3、EDF能特異清除羥自由基，中間的色氨酸殘基對(duì)EDF的羥自由基清除能力至關(guān)重要。
　　4、EDF能保護(hù)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和 DNA免受羥自由基的損傷，這種保護(hù)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)。
　　5、EDF在很低的生理濃度下能抑制Amp的抗菌作用，結(jié)合Cell雜志2007年報(bào)道的Amp類(lèi)抗生素的通用殺菌機(jī)制有可能是由于能夠刺激E. coli產(chǎn)生羥自由基（.OH），我們認(rèn)為EDF除了作為群體感應(yīng)因子導(dǎo)致細(xì)菌的死亡外，還可