吖啶黃的新靶點發(fā)現(xiàn)及其在腫瘤治療中的應用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:吖啶黃作為抗菌藥物曾在臨床上廣泛使用,而近年來其抗腫瘤活性多見諸于報道,被認為是一類具有前景的潛在抗腫瘤藥物。然而針對吖啶黃抗腫瘤作用機制的研究并不多見,更缺乏分子靶點的確證,這極大地限制了吖啶黃在抗腫瘤領域中的進一步應用。本部分研究將以吖啶黃作為研究對象,通過構建基于探針的pull-down系統(tǒng),探討吖啶黃直接結合的蛋白以及潛在的作用靶點;在此基礎上,設計以吖啶黃為主的聯(lián)合用藥方案,考察合用方案的體內外抗腫瘤作用,并深入闡述其分

2、子機制及影響因素。課題旨在發(fā)現(xiàn)吖啶黃全新的作用靶點,指導其在腫瘤治療領域的臨床應用,為腫瘤治療提供可行的聯(lián)合用藥策略;也為開發(fā)具有類似結構的新型抗腫瘤藥物提供科學依據與思路。
  方法:⑴Pull-down實驗與HPLC-MS/MS檢測分析瓊脂糖珠所結合的蛋白;⑵Western blotting考察藥物或其他刺激因素作用后細胞內蛋白水平變化;⑶CCK-8及SRB染色法評價藥物作用下的腫瘤細胞增殖能力;⑷PI單染、AnnexinⅤ-

3、PE/7-AAD染色結合流式細胞術以及DAPI染色法考察細胞凋亡;⑸中性彗星實驗、抗53BP1免疫熒光實驗檢測細胞DSBs損傷及修復情況;⑹建立人源性荷Hela宮頸癌裸小鼠模型和荷HCT116結腸癌裸小鼠模型,檢測藥物的體內協(xié)同抗腫瘤作用;⑺TUNEL法檢測腫瘤組織內凋亡情況;⑻運用siRNA技術沉默p21基因表達;⑼基因表達譜芯片分析相關差異基因的表達。
  結果:①吖啶黃的靶點發(fā)現(xiàn)及對DNA-PK的抑制作用研究:構建并驗證了連

4、接有吖啶黃的NHS活化瓊脂糖珠(ACF-NHS)用于分離吖啶黃結合蛋白(acriflavine-bound proteins)的實驗體系,經HPLC-MS/MS分析,綜合考慮吖啶黃在細胞內的核漿分布,確定包括DNA-PKcs在內的若干核蛋白為吖啶黃靶點蛋白;計算機模擬分子對接、體外酶活性及細胞水平上的放射線/熱刺激造模實驗證實吖啶黃能夠直接結合于DNA-PKcs的激酶區(qū)域,進而抑制其激酶活性。②吖啶黃與美法侖協(xié)同抗腫瘤作用的研究:烷化劑

5、美法侖能夠引起DNA-PKcs活性增加,抑制DNA-PKcs活性能夠增強美法侖作用;吖啶黃與美法侖聯(lián)合用藥能顯著增加后者抑制細胞增殖的作用,增加caspase依賴的細胞凋亡,相比于同時給藥,吖啶黃與美法侖的序貫給藥具有更強的協(xié)同效果;機制上,吖啶黃能夠逆轉美法侖單用所引起的DNA-PKcs激活,從而抑制NHEJ修復,明顯累積DNA雙鏈斷裂(DSBs),進而引起細胞凋亡;這一作用與吖啶黃其他潛在靶點無關;在荷Hela官頸癌裸鼠模型以及荷H

6、CT116結腸癌裸鼠模型中吖啶黃與美法侖表現(xiàn)出良好的體內協(xié)同抗腫瘤作用。③p53影響吖啶黃協(xié)同美法侖抗腫瘤作用的研究:GSEA分析顯示,吖啶黃與美法侖合用顯著影響p53信號通路;體內外實驗證實p53功能或表達缺失將干擾兩藥協(xié)同抗腫瘤作用;吖啶黃與美法侖聯(lián)合用藥后會上調p53下游凋亡相關基因的轉錄,同時促進調控細胞周期的p21基因轉錄及蛋白表達,p21通過抑制CDK2磷酸化進而逆轉美法侖單用所誘導的S期阻滯;敲除p21可使吖啶黃與美法侖協(xié)

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