ICAP1α及突變體T38A、I138A在內(nèi)皮細胞ECV304內(nèi)吞整合素β1中的作用.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：ICAP1α基因及其突變體T38A、I138A真核表達載體的構(gòu)建和鑒定
　　 目的：構(gòu)建并鑒定ICAP1α基因及其突變體T38A、I138A真核表達載體。
　　 方法：以pCMV-SPORT6/ICAP1α質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增ICAP1α基因片段，雙酶切后再與AAV載體重組連接。同時采用重疊PCR定點突變法構(gòu)建其突變體pAAV-T38A，pAAV-I138A表達載體。重組

2、質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和DNA 序列測定,篩選出重組pAAV-ICAP1α、pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表達載體。
　　 結(jié)果：陽性重組質(zhì)粒酶切及測序鑒定和比對與預(yù)期結(jié)果完全相符。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建pAAV-ICAP1α、pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表達載體，可為ICAP1α基因及其突變體T38A、I138A的生物學(xué)功能研究提供基因材料。
　　 第二部分：ICAP1α及突變體T38A、

3、I138A在內(nèi)皮細胞ECV304整合素β1內(nèi)化中的作用
　　 目的：探討ICAP1α及突變體T38A、I138A在內(nèi)皮細胞ECV304內(nèi)化整合素β1中的作用和機制。
　　 方法：構(gòu)建pAAV-ICAP1α及其突變體pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表達載體,轉(zhuǎn)染ECV304，ECV304分為ICAP1α組、T38A組、I138A組、綠色熒光蛋白(GFP)組和未轉(zhuǎn)染組，用可還原的細胞表面生物素(NHS-SS-Bi

4、otin)標(biāo)記整合素β1，并利用生物素-親和素的特性以及western blot檢測整合素β1內(nèi)化情況。
　　 結(jié)果：各組細胞轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒均穩(wěn)定表達；ICAP1α組、T38A組、I138A組、GFP組、未轉(zhuǎn)染組相對光密度值分別為1.07±0.04、0.68±0.06、0.70±0.02、0.87±0.06、0.88±0.04；與GFP組和未轉(zhuǎn)染組比較，ICAP1α組整合素β1內(nèi)化明顯增多(P＜0.05)；與GFP組、未轉(zhuǎn)染組和IC