不同N-P條件下銅綠微囊藻DNA含量分析、差異蛋白組研究及PstB的表達(dá)分析.pdf

1、銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)是富營(yíng)養(yǎng)化湖泊和水庫(kù)中形成“水華”的主要藻種。利用分子生物學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)，研究常見赤潮、水華藻種在特定環(huán)境中的蛋白質(zhì)組差異，從中尋找出有價(jià)值的差異蛋白質(zhì)分子，這在理論和實(shí)踐上對(duì)水華的防治都具有重要意義。 在水華藍(lán)藻的形成因素中，氮磷比例是一個(gè)很大的影響因素，其最適N/P為16:1。我們?cè)O(shè)想，該N/P值是與細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂相關(guān)系的。磷在細(xì)胞中的作用是參與一些代謝途徑的磷酸

2、化反應(yīng)，更重要的可能是與細(xì)胞DNA、RNA的合成有關(guān)；氮?jiǎng)t是參與了蛋白質(zhì)的合成，氮磷之間合適的比例，就代表了細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂之間量的關(guān)系。為了驗(yàn)證此設(shè)想，通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法來檢測(cè)微囊藻細(xì)胞的DNA含量，設(shè)置不同的N/P比值，缺NP、1:1、16:1、160:1四組，結(jié)果表明在N/P為16:1時(shí)，藻細(xì)胞的DNA含量較其他對(duì)照組高，間接地反映了藻細(xì)胞的數(shù)目，即當(dāng)N/P為16:1藻細(xì)胞處于分裂的最佳水平。 微囊藻有較高的磷吸收最大

3、攝取速率，比其它藻類具有更強(qiáng)的儲(chǔ)存磷的能力，可以在細(xì)胞中儲(chǔ)存足夠的磷。因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)，分析銅綠微囊藻在不同磷濃度培養(yǎng)水平下的蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定出關(guān)鍵的差異蛋白，分析這些關(guān)鍵蛋白的作用，對(duì)揭示銅綠微囊藻特殊的磷代謝機(jī)制有一定的幫助。試驗(yàn)中設(shè)置了三個(gè)不同磷濃度的誘導(dǎo)水平：即0.005mg/L，0.05mg/L，0.5mg/L，誘導(dǎo)72h后進(jìn)行差異蛋白組分析。結(jié)果我們獲得了二十多個(gè)差異點(diǎn)，選取其中可靠度較好的十一個(gè)點(diǎn)進(jìn)行

4、質(zhì)譜分析，通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，分析了一些與磷代謝相關(guān)的蛋白：、硫胺素焦磷酸化酶、磷酸核酮糖激酶、磷酸甘油酸激酶、琥珀酰CoA合成酶微囊藻毒素相關(guān)蛋白MrpA等，均與磷代謝、缺磷逆境或者核酸代謝相關(guān)。 為研究蛋白PstB在銅綠微囊藻中與磷吸收代謝的關(guān)系，成功克隆表達(dá)了pstB，純化免疫小鼠，制備多克隆抗體用于檢測(cè)PstB在藻細(xì)胞的表達(dá)變化。結(jié)果表明，在缺磷條件下，PstB表達(dá)量顯著提高，而隨著磷濃度的提高，PstB表達(dá)量反而降低至本底