銅綠微囊藻生物防控過(guò)程中的藻毒素分析.pdf

1、如今，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，藍(lán)藻水華的暴發(fā)也越來(lái)越頻繁，使水生態(tài)系統(tǒng)遭到嚴(yán)重的影響，直接威脅人類健康和其他動(dòng)植物的生存。其中，銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是最為常見(jiàn)的水華藻類，在我國(guó)尤為嚴(yán)重。它所產(chǎn)生微囊藻毒素（Microcystins，簡(jiǎn)稱MC），是藍(lán)藻所產(chǎn)生藻毒素中最為普遍、危害最大、研究最多的一種，能引起肝癌等疾病。國(guó)內(nèi)外一直對(duì)藍(lán)藻水華問(wèn)題予以高度重視，目前相關(guān)防治方法很多，其中

2、以生物操控法最具潛力和發(fā)展前景;人們對(duì)藻毒素的檢測(cè)方法也一直有所研究，主要有生物學(xué)檢測(cè)方法、分析化學(xué)檢測(cè)法、生物化學(xué)檢測(cè)法。
　　本文選擇椎實(shí)螺作為主要控藻生物，探討其對(duì)不同銅綠微囊藻的控制效果，探究了銅綠微囊藻在生長(zhǎng)過(guò)程中各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，并與其他生物控藻方法對(duì)比分析，同時(shí)對(duì)該過(guò)程中藻毒素進(jìn)行檢測(cè)分析，找出一個(gè)既能很好抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)又能有效控制藻毒素含量的最適方法，且能夠用于實(shí)際養(yǎng)殖水體中。具體而言，本研究探討了椎實(shí)螺對(duì)它

3、們的控藻效果，跟蹤測(cè)定了四種銅綠微囊藻生長(zhǎng)過(guò)程中的各項(xiàng)指標(biāo)變化情況;同時(shí)對(duì)此過(guò)程中水中毒素進(jìn)行檢測(cè)分析;在自然條件、模擬系統(tǒng)條件和實(shí)驗(yàn)室條件下，對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)鹽濃度下銅綠微囊藻的各項(xiàng)指標(biāo)跟蹤測(cè)定并分析，探討不同生物方法對(duì)銅綠微囊藻的影響，找出一個(gè)既能很好抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)，又能控制藻毒素含量的最適方法。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)四種銅綠微囊藻生長(zhǎng)過(guò)程中各項(xiàng)指標(biāo)的分析
　　選擇四種銅綠微囊藻（分別簡(jiǎn)稱T1343、T905、T9

4、42、T918）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，跟蹤測(cè)定其各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)，包括藻細(xì)胞數(shù)、OD值、葉綠素a濃度、藻藍(lán)蛋白含量、胞外MC-LR、總MC和總毒性，并進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，這四種銅綠的藻細(xì)胞數(shù)均隨時(shí)間呈良好的指數(shù)增長(zhǎng)關(guān)系，6天后增長(zhǎng)量為168.08×105cell/ml、41.70×105cell/ml、83.25×105cell/ml、33.25×105cell/ml，T1343＞T942＞T905＞T918。OD600nm（酶標(biāo)儀）、OD600n

5、m（分光光度計(jì)）、葉綠素a濃度和藻藍(lán)蛋白含量均與藻細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系，各指標(biāo)增長(zhǎng)系數(shù)（上述指標(biāo)和細(xì)胞密度關(guān)系曲線的斜率）最大值分別為T905=T918(0.001)、T905=T918(0.0041)、T918(6.3018)和T905(0.1508)。四種銅綠微囊藻的胞外MC-LR濃度、胞外總MC濃度、以及T905、T918的胞外總毒性均隨藻細(xì)胞數(shù)呈線性增長(zhǎng)關(guān)系，最大的增長(zhǎng)系數(shù)分別為T918(0.1968)、T918(0.6938

6、)、T905(2.0593)，T1343和T942的胞外總毒性隨藻細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)關(guān)系。由上可以看出，T918的OD值、葉綠素a濃度、胞外MC-LR、胞外總MC隨藻細(xì)胞的增長(zhǎng)速率均最大，可將其最為重點(diǎn)研究對(duì)象。
　　(2)椎實(shí)螺控制銅綠微囊藻的效果及其過(guò)程中藻毒素的初步分析
　　針對(duì)椎實(shí)螺對(duì)四種銅綠微囊藻（分別簡(jiǎn)稱T1343、T905、T918、T942）的控制效果進(jìn)行了探討驗(yàn)證并對(duì)比分析。結(jié)果表明，加螺實(shí)驗(yàn)組最后的藻細(xì)胞數(shù)均

7、達(dá)到最低值分別為28×105 cell/ml、17.25×105 cell/ml、21.50×105 cell/ml、4.75×105 cell/ml，遠(yuǎn)小于對(duì)照組(1172.50×105 cell/ml、127.75×105 cell/ml、245.25×105 cell/ml、60.00×105 cell/ml)。說(shuō)明椎實(shí)螺對(duì)這四種銅綠微囊藻均有顯著的控制效果。
　　統(tǒng)計(jì)最終椎實(shí)螺的存活數(shù)，并對(duì)加入椎實(shí)螺控水中起止MC-LR、

8、總MC和總毒性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，四種銅綠微囊藻實(shí)驗(yàn)組椎實(shí)螺的存活率分別為33.33％、60％、26.67％、75％。椎實(shí)螺對(duì)T1343、T942、T918的胞外MC-LR均有一定的控制效果，最后實(shí)驗(yàn)組MC-LR分別為0μg/L、0.106μg/L、28.867μg/L，均小于對(duì)照組（0.199μg/L、25.349μg/L、34.991μg/L）;對(duì)T1343、T905、T942的胞外總MC均有一定的控制效果，最后實(shí)驗(yàn)組總MC分別為0

9、.856μg/L、159.210μg/L、2.090μg/L，均小于對(duì)照組(1.785μg/L、177.622μg/L、221.080μg/L);對(duì)這四種銅綠微囊藻的胞外總毒性均有一定的控制效果，最后實(shí)驗(yàn)組總毒性分別為4.827mg/L、2.448 mg/L、2.046 mg/L、0.796 mg/L的CuSO4毒性，均小于對(duì)照組(13.602 mg/L、586.414mg/L、542.260mg/L、70.755mg/L的CuSO4毒

10、性)。綜上可以看出，椎實(shí)螺對(duì)T942的胞外總MC及T905、T942、T918的胞外總毒性的控制效果較顯著，T1343所產(chǎn)生的胞外毒素很少。
　　(3)不同營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響
　　探討了自然條件下不同N、P濃度對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響，以及實(shí)驗(yàn)室條件下不同N、P、Fe濃度對(duì)T918的生長(zhǎng)情況及此過(guò)程中胞外MC和總毒性的影響變化情況。
　　自然條件下，選擇縮小10倍的BG-11培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上

11、改變NaNO3、KH2PO4的濃度，從而改變N、P濃度，分別記為NP、5NP、N5P。結(jié)果表明:第35天時(shí)，T918藻細(xì)胞數(shù)大小為N5P(111.375×105 cell/ml)＞NP(86.750×105 cell/ml)＞5NP(43.125×105 cell/ml)，即NaNO3和KH2PO4濃度分別在0.15 g/L和0.02 g/L時(shí)藻細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)最快，在0.75 g/L和0.004 g/L時(shí)增長(zhǎng)最慢。說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，P濃

12、度越高，銅綠微囊藻生長(zhǎng)越好;而N濃度越大，有時(shí)卻會(huì)抑制它的生長(zhǎng)，但由于影響因素過(guò)多，需要進(jìn)一步探究。
　　選擇T918在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行研究，NPFe表示BG-11培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上改變NaNO3、KH2PO4、檸檬酸鐵銨的濃度，從而改變N、P、Fe濃度，分別記為NPFe、1/5NPFe、5NPFe、N1/5PFe、N5PFe、NP1/5Fe、NP5Fe。第8天時(shí)，藻細(xì)胞數(shù)最優(yōu)和最差濃度條件分別為5NPFe(147.50×105

13、cell/ml)和1/5NPFe(101.50×105 cell/ml);OD600nm（酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)）最優(yōu)條件為N5PFe（0.211和0.534），其他條件下區(qū)別不顯著。第10天時(shí)，葉綠素a濃度最優(yōu)和最差濃度條件分別為N5PFe（810.92μg/L）和N1/5PFe(344.34μg/L);胞外MC-LR濃度最優(yōu)條件為1/5NPFe（8.830μg/L），其次為N1/5PFe(5.131μg/L)，其他條件區(qū)別不明顯;胞外總

14、MC濃度最優(yōu)條件為5NPFe(125.112μg/L)，其次是N5PFe(99.346μg/L)，最差為NP1/5Fe（53.297μg/L）。第8天時(shí)，胞外總毒性用CuSO4來(lái)表征，最優(yōu)條件為5NPFe（14.813 mg/L），其次為NPFe(7.834 mg/L)，最差為N1/5PFe(1.676 mg/L)。綜上可以看出，對(duì)T918的OD600nm和葉綠素a影響最大的是P元素，在KH2PO4濃度為0.008-0.200 g/L范

15、圍內(nèi)，N和Fe濃度不變時(shí)，P濃度越大，兩者越大;對(duì)藻細(xì)胞數(shù)、胞外MC和毒性影響最大的是N元素，NaNO3濃度為0.3-7.5 g/L范圍內(nèi)，P和Fe濃度不變時(shí)，N濃度越大，藻細(xì)胞數(shù)、胞外MC-LR、總MC、總毒性越大。
　　(4)不同生物方法對(duì)T918的控制效果及其過(guò)程中藻毒素的分析
　　探討了實(shí)驗(yàn)室條件下，椎實(shí)螺、浮萍、EM菌、椎實(shí)螺+浮萍、椎實(shí)螺+EM菌、小球藻對(duì)T918的控制效果及其過(guò)程中胞內(nèi)外藻毒素的變化情況，并對(duì)最

16、后椎實(shí)螺體內(nèi)的藻毒素進(jìn)行了檢測(cè)，另外探討了相應(yīng)模擬生態(tài)系統(tǒng)條件下的結(jié)果。
　　實(shí)驗(yàn)室條件結(jié)果如下:椎實(shí)螺、浮萍、浮萍+椎實(shí)螺、EM菌+椎實(shí)螺對(duì)T918藻細(xì)胞數(shù)均有顯著的控制效果，第8天的藻細(xì)胞數(shù)幾乎為0，遠(yuǎn)小于對(duì)照組(105.50×105 cell/ml);椎實(shí)螺、浮萍及椎實(shí)螺+浮萍均對(duì)OD600nm（酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)）均有顯著的控制效果，第8天的值分別為0.034和0.051、0.035和0.054、0.038和0.053，遠(yuǎn)

17、小于對(duì)照組(0.203和0.473);椎實(shí)螺、浮萍、椎實(shí)螺+浮萍、椎實(shí)螺+EM菌對(duì)葉綠素a濃度均有顯著的控制效果，第8天值分別為31.24μg/L、41.89μg/L、52.14μg/L、67.25μg/L，遠(yuǎn)小于對(duì)照組(370.02μg/L);椎實(shí)螺、浮萍、椎實(shí)螺+浮萍、椎實(shí)螺+EM菌對(duì)胞內(nèi)和胞外MC-LR均有顯著的控制效果，第8天的值均為0，遠(yuǎn)小于對(duì)照組（153.018μg/L和7.403μg/L）;椎實(shí)螺、浮萍、椎實(shí)螺+浮萍、椎實(shí)

18、螺+EM菌均對(duì)胞內(nèi)和胞外總MC有顯著的控制效果，第8天的值分別為0.061μg/L和8.134μg/L、0.019μg/L和7.067μg/L、0.016μg/L和6.598μg/L、2.218μg/L和11.629μg/L，遠(yuǎn)小于對(duì)照組（108.903μg/L和116.006μg/L）;椎實(shí)螺、浮萍、椎實(shí)螺+浮萍對(duì)胞外總毒性具有顯著的控制效果，第3天的值分別為10.578mg/L、8.699 mg/L、5.892mg/L的CuSO4毒

19、性，遠(yuǎn)小于對(duì)照組（635.118 mg/L的CuSO4毒性）。
　　模擬生態(tài)系統(tǒng)結(jié)果如下:未加鯉魚時(shí)，椎實(shí)螺+浮萍對(duì)T918藻細(xì)胞數(shù)控制效果最佳，第4天值為1.25×105 cell/ml，遠(yuǎn)小于對(duì)照組(13.25×105 cell/ml);加鯉魚時(shí)，椎實(shí)螺+浮萍控制效果最佳，其值為2.25×105cell/ml，小于加鯉魚對(duì)照組(5.75×105 cell/ml)。未加鯉魚時(shí)，椎實(shí)螺+浮萍控制OD600nm（分光光度計(jì)）效果最佳

20、，第5天值為0.047，遠(yuǎn)小于對(duì)照組(0.091);加鯉魚時(shí)，鯉魚對(duì)OD600nm起到了顯著的控制作用，其值達(dá)到0.052，遠(yuǎn)小于對(duì)照組(0.091)，其他條件控制效果不顯著，酶標(biāo)儀測(cè)得OD600nm情況與之一致。未加鯉魚時(shí)，椎實(shí)螺+浮萍對(duì)葉綠素a控制效果最佳，第4天值為36.14μg/L，遠(yuǎn)小于對(duì)照組(74.16μg/L);加鯉魚時(shí)，椎實(shí)螺+浮萍控制葉綠素a效果最佳，其值為58.07μg/L，小于加鯉魚對(duì)照組（77.06μg/L）。<

21、br>　　實(shí)驗(yàn)最后椎實(shí)螺體內(nèi)殘留MC和毒性情況:實(shí)驗(yàn)室條件下，第2組（T918+椎實(shí)螺）、第5組（T918+椎實(shí)螺+浮萍）和第6組（T918+椎實(shí)螺+EM菌）椎實(shí)螺存活率分別為40％、77％和0％，說(shuō)明一定量的浮萍有利于椎實(shí)螺的生長(zhǎng)，而EM菌嚴(yán)重危害了其生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)最后第2組和第5組椎實(shí)螺體內(nèi)殘留MC-LR幾乎均為0;總MC含量分別為15.551μg/kg和6.749μg/kg;總毒性殘留量分別為2332.982mg/kg和1789.71

22、8mg/kg的CuSO4毒性，說(shuō)明一定量的浮萍不僅提高了椎實(shí)螺的存活率，且能減少其體內(nèi)毒素殘留量。模擬生態(tài)系統(tǒng)條件下，2號(hào)水缸（T918+鯉魚）、4號(hào)水缸（T918+椎實(shí)螺+鯉魚）和6號(hào)水缸（T918+椎實(shí)螺+浮萍+鯉魚）鯉魚存活率分別為80％、60％和80％，說(shuō)明一定量的浮萍有利于鯉魚的生長(zhǎng)。3號(hào)水缸（T918+椎實(shí)螺）中椎實(shí)螺存活率為52％;4號(hào)、5號(hào)（T918+椎實(shí)螺+浮萍）、6號(hào)水缸中椎實(shí)螺存活率均為48％，說(shuō)明一定量的浮萍不會(huì)

23、對(duì)椎實(shí)螺造成嚴(yán)重的傷害。實(shí)驗(yàn)最后3、4、5、6號(hào)水缸中椎實(shí)螺體內(nèi)幾乎沒(méi)有殘留MC-LR;總MC含量分別為17.453μg/kg、22.515μg/kg、6.535μg/kg、10.694μg/kg;總毒性含量分別為2534.472mg/kg、2526.969mg/kg、1732.377mg/kg、1743.984mg/kg的CuSO4毒性，說(shuō)明加入鯉魚水缸中椎實(shí)螺殘留總MC含量要高于未加鯉魚的水缸，加入浮萍的水缸中椎實(shí)螺體內(nèi)殘留總MC含

24、量和總毒性均低于未加浮萍的水缸。綜上說(shuō)明，一定量的浮萍能使椎實(shí)螺體內(nèi)毒素殘留量減少。
　　本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，椎實(shí)螺能顯著抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，但高濃度藻細(xì)胞也使得椎實(shí)螺大量死亡，水體變成黃色，水中藻毒素殘留量偏高?？紤]結(jié)合其他生物方法來(lái)進(jìn)行控藻，與椎實(shí)螺控藻效果進(jìn)行對(duì)比分析，可以看出，椎實(shí)螺與浮萍混合得方法既能很好地控制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，又能提高椎實(shí)螺及鯉魚的存活率，并且使得胞內(nèi)外的藻毒素和毒性得到了更為顯著的控制，同時(shí)又使得最后