苯并芘的早期妊娠毒性研究及五味子乙素調(diào)控AhR信號通路在預(yù)防HTR8-SVneo細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、目的：
　　以雌性SD大鼠和滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo為研究載體，分別建立苯并芘及其代謝產(chǎn)物的動物和細(xì)胞染毒模型及藥物干預(yù)模型，探討苯并芘的早期妊娠毒性機(jī)制及AhR信號通路在五味子乙素預(yù)防苯并芘代謝產(chǎn)物致人早孕胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷中的作用，闡明五味子乙素抗多環(huán)芳烴類污染物生殖毒性的機(jī)制，為臨床開發(fā)安全、有效的環(huán)境污染防護(hù)劑奠定科學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　動物實驗：將75只雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組：空白對照組、

2、Bap模型組、五味子低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組15只。每日晨起灌胃給藥，Bap模型組予BaP2 mg·kg-1·d，五味子低、中、高劑量組分別予五味子提取物40、200、1000 mg·kg-1·d+BaP2 mg·kg-1·d，空白對照組予相同體積的生理鹽水。給藥15天后制備孕鼠模型，于妊娠第9日處死孕鼠，觀察胚胎情況，記錄孕鼠各期體質(zhì)量、子宮連胚總質(zhì)量并計算臟器系數(shù)，透射電鏡觀察胚胎超微結(jié)構(gòu)變化；氧化損傷試劑盒檢測大鼠胚胎組

3、織中SOD、GSH-Px活性水平和MDA含量；ELISA試劑盒檢測大鼠胚胎組織8-OHdG含量；熒光定量PCR檢測大鼠胚胎中Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測大鼠胚胎中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平。
　　細(xì)胞實驗：以滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo為載體，通過MTS檢測細(xì)胞活力并明確染毒藥物BPDE及保護(hù)藥物五味子乙素的劑量，構(gòu)建細(xì)胞染毒模型及藥物干預(yù)模型；

4、利用小RNA干擾技術(shù)和載體質(zhì)粒的構(gòu)建，分別在HTR8/SVneo細(xì)胞株上實現(xiàn)目的基因AhR的沉默和過表達(dá)，并通過熒光定量PCR和免疫印跡分別從基因和蛋白水平對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗證；熒光定量PCR檢測AhR目的基因沉默和過表達(dá)前后AhR及其下游CYP1A1 mRNA表達(dá)水平及凋亡基因Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠一般情況及胚胎形態(tài)學(xué)比較：
　　與空白對照組相比，Bap模型組大鼠體質(zhì)量

5、、子宮連胚總系數(shù)均下降（P＜0.01）；五味子提取物治療后，五味子干預(yù)組各組孕鼠體質(zhì)量、子宮連胚總系數(shù)水平較Bap模型組不同程度上升(P＜0.01或P＜0.05)。空白對照組及五味子干預(yù)組大鼠胚胎肉眼觀無明顯異常，透射電鏡示胚胎超微結(jié)構(gòu)未見明顯異常；Bap模型組大鼠胚胎大小不一，表面可見異常出血斑塊，電鏡示超微結(jié)構(gòu)異常，凋亡細(xì)胞增加，胚胎內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)異常凋亡結(jié)構(gòu)。
　　2.大鼠胚胎氧化損傷指標(biāo)SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較

6、：
　　與空白對照組相比，Bap模型組大鼠胚胎中SOD、GSH-Px活性顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；五味子提取物治療后，五味子高、中、低組大鼠胚胎中SOD活性較模型組不同程度上升(P＜0.01或P＜0.05)，五味子高劑量組GSH-Px活性較模型組上升（P＜0.05），五味子高劑量組MDA含量較模型組下降（P＜0.05）。
　　3.大鼠胚胎DNA損傷指標(biāo)8-OHdG比較：

7、>　　與空白對照組相比，Bap模型組大鼠胚胎中8-OHdG水平顯著上升(P＜0.01)；五味子提取物治療后，五味子高、中劑量組大鼠胚胎中8-OHdG水平較模型組不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05)。
　　4.大鼠胚胎凋亡指標(biāo)Bax、Bcl-2、Caspase-3比較：
　　與空白對照組相比，Bap模型組大鼠胚胎Bax及Caspase-3 mRNA水平及蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平及蛋白表達(dá)下調(diào)

8、（P＜0.01）；五味子提取物治療后，五味子高、中、低劑量組大鼠胚胎Bax及Caspase-3 mRNA水平及蛋白表達(dá)較模型組出現(xiàn)不同程度下調(diào)（P＜0.01或P＜0.05），五味子高、中劑量組大鼠胚胎Bcl-2 mRNA水平及蛋白表達(dá)較模型組出現(xiàn)不同程度上調(diào)（P＜0.01或P＜0.05）。
　　5.BPDE及五味子乙素對細(xì)胞活力的影響：
　　BPDE可劑量依賴性誘導(dǎo)HTR8/SVneo細(xì)胞活力下降，其IC50約為3.54μM

9、，選取5μM（約為IC60）為BPDE的終染毒劑量；Sch B(0.625μM～10μM)對BPDE誘導(dǎo)的HTR8/SVneo細(xì)胞活力下降有顯著的抑制作用，選取10μM為五味子乙素終干預(yù)劑量。
　　6.AhR目的基因沉默前后AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平比較：
　　①組內(nèi)比較：與沉默前未處理組相比，BPDE組AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01或P＜0.05）；與沉默后未處理組相比，BPDE組Ah

10、R、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01）。與沉默前BPDE組相比，Sch B干預(yù)組AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.01）；與沉默后未處理組相比，BPDE組AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01或P＜0.05）。
　?、诮M間比較：沉默后未處理組、BPDE組及Sch B組AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平均較沉默前明顯下調(diào)（P＜0.01）。
　　7.AhR目的基因過表達(dá)前后

11、AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平比較：
　?、俳M內(nèi)比較：與過表達(dá)前未處理組相比，BPDE組AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01）；與過表達(dá)后未處理組相比，BPDE組AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.01或P＜0.05）。與過表達(dá)前BPDE組相比，Sch B組AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.01或P＜0.05）；與過表達(dá)后未處理組相比，BPDE組AhR mRNA表達(dá)水

12、平下調(diào)（P＜0.01或P＜0.05），但CYP1A1 mRNA表達(dá)水平無顯著變化（P＞0.05）。
　　②組間比較：過表達(dá)后未處理組、BPDE組及Sch B組AhR、CYP1A1 mRNA表達(dá)水平均較過表達(dá)前明顯上調(diào)（P＜0.01）。
　　8.AhR目的基因沉默前后Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較：
　?、俳M內(nèi)比較：與沉默前未處理組相比，BPDE組Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＜0

13、.01）；Sch B干預(yù)后，Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.01）。與沉默后未處理組相比，BPDE組Bax mRNA表達(dá)水平無顯著變化（P＞0.05），Caspase-3 mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）；Sch B干預(yù)后，Bax mRNA表達(dá)水平無顯著變化（P＞0.05），Caspase-3 mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。
　?、诮M間比較：沉默前后未處理組Bax、Caspase-3 mRNA

14、表達(dá)均無明顯變化（P＞0.05）；沉默前后BPDE組及Sch B組Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.01或P＜0.05）。
　　9.AhR目的基因過表達(dá)前后Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較：
　?、俳M內(nèi)比較：與過表達(dá)前未處理組相比，BPDE組Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01），Sch B干預(yù)后，Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.0

15、1）。與過表達(dá)后未處理組相比，BPDE組Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.01）， Sch B干預(yù)后，Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.01或P＜0.05）。
　?、诮M間比較：過表達(dá)后未處理組、BPDE組及Sch B組Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平均無顯著變化（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　經(jīng)雌性SD大鼠模型和HTR8/SVneo細(xì)胞模型的體內(nèi)外研究證