日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗的構(gòu)建及其誘導(dǎo)BALB-c鼠免疫應(yīng)答的動態(tài)研究.pdf

1、目的：日本血吸蟲病屬我國規(guī)劃防治的嚴(yán)重寄生蟲病之一，現(xiàn)有血吸蟲病疫苗由于各種不足均未能應(yīng)用于臨床，因此，開發(fā)新型疫苗是預(yù)防該病的必經(jīng)之路。本研究擬擴(kuò)增日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,Sj)32抗原編碼基因，以兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)為“載體”，構(gòu)建日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj32)疫苗，并進(jìn)一步觀察該疫苗誘導(dǎo)BALB/c鼠免疫反應(yīng)的動態(tài)變化，為日本血吸蟲病的防治

2、提供一種新型疫苗。
　　方法：
　　1.從本室保存的 BL21(pET28α-Sj32)重組菌中抽提質(zhì)粒pET28α-Sj32，并以該質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到Sj32抗原編碼基因，利用基因重組技術(shù)將此目的基因插入載體 pGEX-1λT，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-Sj32，以電穿孔法將其轉(zhuǎn)化到Bb中，獲得重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗；仍采用電穿孔法將 pGEX-Sj32轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(Escherichia coli，E

3、.coli)BL21(DE3)中加 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白印跡(Western blot)技術(shù)鑒定其表達(dá)產(chǎn)物。
　　2.將重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗分別經(jīng)口服(Per os,PO)和滴鼻(Intranasal,IN)途徑免疫BALB/c鼠，動態(tài)觀察免疫后0~20周該疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答變化，以常規(guī)ELISA法檢測血清抗體IgG及其亞類、IgE和IgA水平，雙抗體夾

4、心ELISA法檢測血清細(xì)胞因子及脾細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子(TNF-α、IL-10和IL-12)的動態(tài)變化，四甲基偶氮唑鹽比色法(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)分析免疫后不同時間點脾臟淋巴細(xì)胞增殖水平、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測小鼠脾臟中T細(xì)胞(CD4+T和CD8+T)亞群分化和脾細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1.成功擴(kuò)增出長度為1270 bp的Sj32抗原編碼基因

5、；雙酶切證實質(zhì)粒pGEX-1λT與Sj32基因重組成功；在重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗中PCR擴(kuò)增出1270 bp的Sj32基因片段,與目的基因長度相符；重組質(zhì)粒pGEX-Sj32可在大腸埃希菌中被IPTG誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳證實為相對分子質(zhì)量約58 kDa的重組蛋白,以誘導(dǎo)后5~7h表達(dá)效率較高;Western blot顯示該重組蛋白可被日本血吸蟲感染的兔血清所識別。
　　2.動態(tài)研究表明：
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6、1）血清抗體及細(xì)胞因子 PO組血清抗體IgG及其亞類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA均于8周達(dá)最高水平，而IN組除IgG2b和Ig3于12周、IgE于14周達(dá)較高水平外，其余均于8周達(dá)最高值；兩組血清細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α分別在免疫后(PO組)14、6和8周及(IN組)8、6和8周達(dá)最高水平；
　?。?）脾細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子變化 PO組和IN組脾細(xì)胞增殖均于免疫后6周達(dá)最高值；分別于6周和8周

7、達(dá)最大脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率；脾CD4+T細(xì)胞亞群百分比分別在6周和8周達(dá)最高值，而兩組CD8+T細(xì)胞亞群百分比在免疫后2~20周升高不顯著，與0周相比無統(tǒng)計學(xué)差異；PO組脾細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平均分別于免疫后10周、6周和8周達(dá)最大值，IN組分別在12周、8周和8周達(dá)最大值。
　　結(jié)論：
　　1.成功將目的基因Sj32與載體連接，得到重組質(zhì)粒pGEX-Sj32，
　　2.pGEX-Sj32被成功引入