腦脊液改良抗酸染色法的建立與臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)，是由結(jié)核分枝桿菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，是結(jié)核病中最嚴重的類型之一，如不及時治療其破壞性和預(yù)后非常差，所以早期診斷和及時治療對于降低發(fā)病率和死亡率至關(guān)重要。結(jié)核性腦膜炎的診斷最為困難，往往和病毒性腦膜炎、細菌性腦膜炎、腦膜癌相混淆，很不容易分辨清楚，結(jié)核性腦膜炎的診斷以發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌或者以培養(yǎng)出結(jié)核桿菌作為“金標準”[1]但是因為腦脊液標本量少，而涂片傳統(tǒng)抗

2、酸染色和結(jié)核菌培養(yǎng)需要大量的腦脊液標本，往往對結(jié)核桿菌的檢出率非常低，傳統(tǒng)抗酸染色有報道檢出率在10％以內(nèi)[2-3]傳統(tǒng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)法羅氏法(Lowenstein-Jensen)需要時間長，大約在4-6周才會檢測出結(jié)核桿菌的生長[4]，雖然現(xiàn)在有先進的BD液體快速培養(yǎng)技術(shù)，但是也往往需要2-3周才會觀察到結(jié)核桿菌生長[21]，這樣往往會耽誤病情診斷及后續(xù)治療。血清學(xué)方法比較方便，但是缺乏敏感性和特異性，往往作為輔助診斷[5]。近年來，D

3、NA技術(shù)以及其他快速培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使得檢測結(jié)核桿菌的時間大大縮短，但由于價格昂貴，不適用于在臨床廣泛使用。本研究旨在探尋一種快速、高效、經(jīng)濟的臨床檢測方法便于推廣普查結(jié)核性腦膜炎的臨床檢測方法，鑒于抗酸染色是結(jié)核桿菌感染的最佳診斷方法但其對結(jié)腦患者CSF檢出率低，不適用于TBM的普查診斷。因此本研究欲將在傳統(tǒng)抗酸染色的基礎(chǔ)上建立的改良抗酸染色法和目前臨床實驗室針對腦結(jié)核病進行的多種診斷方法（包括濃縮集菌抗酸染色，傳統(tǒng)抗酸染色，腦脊液AD

4、A檢測，實時熒光定量PCR技術(shù)等）做一個平行比較以及分析在病情發(fā)展過程中相互之間的關(guān)系，以了解其在TBM診斷中的陽性率，突出改良抗酸染色在對結(jié)腦的診斷中陽性率高，準確，操作簡便，快速等優(yōu)點，為改良抗酸染色在臨床TBM的篩查提供理論依據(jù)。
　　方法:1、收集河北省胸科醫(yī)院2014年1月-2014年10月結(jié)核內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科疑似結(jié)核性腦膜炎的64位患者腦脊液216份標本（每位患者采集不低于3份標本且間隔時間都不低于一周），患者都是從14

5、年1月開始新入院。
　　2、指標檢測:對采集的64位疑似結(jié)核性腦膜炎的患者共216份標本進行了改良抗酸染色檢查。這216份標本還分別進行了腦脊液常規(guī)檢查、腦脊液濃縮集菌抗酸染色檢查、腦脊液普通涂片染色檢查、腦脊液生化檢查（項目包括腦脊液葡萄糖測定、腦脊液Cl離子測定、腦脊液蛋白測定、腦脊液ADA測定）、腦脊液細胞學(xué)檢查（在入院第一或第二天就進行了腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)，有27例患者進行了FQ-PCR檢測）。
　　3、指標分析:將改

6、良抗酸染色結(jié)果與其他各項常規(guī)檢查結(jié)果進行對比，比較檢出率差異，綜合患者各項臨床指標，最后確診是否為結(jié)核性腦膜炎
　　4、統(tǒng)計分析:采用卡方檢驗比較檢出率有無差異。檢驗水準α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1、實驗結(jié)束后，調(diào)閱臨床資料:這64例患者中經(jīng)過診斷性治療，未用抗結(jié)核治療臨床病情好轉(zhuǎn)的有31例，其中確診隱球菌感染3例即腦脊液墨汁染色發(fā)現(xiàn)新生隱球菌，腦膜癌4例即經(jīng)病理診斷發(fā)現(xiàn)癌細胞，懷疑是肺癌腦轉(zhuǎn)移;24例是病毒性腦

7、膜炎或細菌性腦膜炎，且未經(jīng)過抗結(jié)核治療病情明顯好轉(zhuǎn)。此課題中病例組33例，陰性對照組31例。
　　2、與目前臨床實驗室常用的結(jié)核菌檢測技術(shù)相比改良抗酸染色提高了結(jié)核性腦膜炎患者CSF中結(jié)核桿菌的陽性率，縮短了檢查時間，當(dāng)天就可得到結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌形態(tài)觀察:光學(xué)顯微鏡下，淡藍色背景，呈現(xiàn)紅色桿狀，細長，部分略微彎曲，偶見成堆分布呈柵欄樣的桿菌，以胞外菌居多，偶見胞內(nèi)菌。
　　3、結(jié)腦組有27例患者進行腦脊液FQ-PCR，檢測

8、出分支桿菌DNA有23例為陽性。改良抗酸染色對33例患者第一次送檢的腦脊液進行改良抗酸染色有29例檢出抗酸桿菌，兩種方法檢出率相比較，P＞0.05，兩種方法對結(jié)核桿菌的檢出率比較不具有統(tǒng)計學(xué)差別。
　　4、腦脊液改良抗酸染色與傳統(tǒng)抗酸染色對腦脊液中結(jié)核桿菌檢出率的比較，病例組107例改良抗酸染色中陽性例數(shù)65份，陽性率60.75％，傳統(tǒng)抗酸染色陽性例數(shù)6份，陽性率5.61％。所以改良抗酸對腦脊液中結(jié)核桿菌的檢出率比傳統(tǒng)抗酸染色檢出

9、率高，兩種方法比較P＜0.005，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、腦脊液細胞數(shù)與改良抗酸之間的關(guān)系，病例組107份標本，發(fā)現(xiàn)在腦脊液細胞計數(shù)中白細胞數(shù)達到100以上有42份，改良抗酸染色發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌26份，陽性率61.9％;白細胞計數(shù)小于100的有65份，改良抗酸染色39份是陽性，率是60％。兩組陽性率比較P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6、腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)方法與腦脊液改良抗酸染色法的比較:病例組107份改良抗酸染色中陽性例數(shù)65

10、份，陽性率60.75％，腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)方法陽性標本僅3份，陽性率僅2.8％。所以改良抗酸染色法比腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)方法檢出率高，兩種方法比較P＜0.005，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　7、腦脊液改良抗酸染色法與腦脊液細胞學(xué)之間的關(guān)系，這64例疑似顱內(nèi)感染的患者，初期送檢的腦脊液細胞學(xué)分析中，多分葉核中性粒細胞占百分比多在60％以上，并且在隨著治療的過程的進行，分葉核中性粒細胞比重呈現(xiàn)進行性下降，激活單核細胞，和淋巴細胞比例上升。針對這6

11、4例疑似患者多次平行腦脊液細胞學(xué)分析和改良抗酸染色分析。分葉核中性粒細胞占比大的發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌27例，并且細胞數(shù)隨治療時間的延續(xù)呈進行性減少。所以腦脊液細胞學(xué)分析中性分葉核細胞居多的標本，結(jié)核桿菌陽性率明顯高于淋巴細胞比例高的標本。兩者比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　8、腦脊液改良抗酸染色與腦脊液生化中ADA活性檢查的對比:腺苷脫氨酶（ADA）在結(jié)核性腦膜炎初期時活性會顯著增高，此課題在216份腦脊液分析中分別進行了ADA檢測和改良抗酸染

12、色，以ADA活性水平4U/L為界限，ADA顯著增高的有78份標本，其中用改良抗酸染色法檢測出結(jié)核菌陽性標本為59份，陽性率75.6％。其余138份腦脊液標本中ADA活性＜4U/L，有6份檢出抗酸桿菌，檢出率4.34％。兩種方法比較P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　9、腦脊液改良抗酸染色法與濃縮集菌法對結(jié)核菌檢出率的比較:病例組初次送檢33份標本改良抗酸法陽性有29份，陽性率87.8％，濃縮集菌法33份標本中陽性有6份，陽性率18.

13、2％，兩種方法陽性率的比較P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　10、改良抗酸染色法改良抗酸染色法陽性率與治療前后的關(guān)系:33份腦脊液抗結(jié)核療前行改良抗酸染色與74份腦脊液抗結(jié)核治療后再次行改良抗酸染色，進行比較，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、改良抗酸染色相較于傳統(tǒng)抗酸染色1改良抗酸染色相較于傳統(tǒng)抗酸染色，濃縮集菌抗酸染色法及結(jié)核桿菌培養(yǎng)等明顯提高了腦脊液抗酸桿菌的檢出率，操作步驟簡單。對臨床快速準確診

14、斷結(jié)核性腦膜炎具有非常高的應(yīng)用價值，可以作為臨床對結(jié)核性腦膜炎的最佳初篩試驗。
　　2、針對同一結(jié)核性腦膜炎患者CSF標本，中性分葉核居多的腦脊液標本陽性率率明顯高于非中性分葉核細胞比例居多的腦脊液標本。腦脊液中細胞類型的變化可用于神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的病情觀察指標。
　　3、腦脊液ADA的檢測可作為結(jié)核性腦膜炎的早期輔助診斷、觀察病情和療效的常規(guī)檢查項目。
　　4、腦脊液改良抗酸染色與實時熒光定量PCR相比較，兩者對腦