基于三維打印技術的載藥抗結核骨支架的構建與特性研究.pdf

1、肺結核病是一個很古老的疾病，目前為我國的乙類傳染性疾病，新中國成立以來，結核病得到了一定程度的控制，但近年來全球肺結核病例有卷土重來之勢，作為肺外結核常見并發(fā)癥之一的骨關節(jié)結核，由于其存在的難治性及復發(fā)性，已成為醫(yī)學上的一項重大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)治療骨結核的方法主要是全身化療與手術治療相結合，全身給藥存在著骨結核病灶處藥物濃度低以及肝腎毒性大等問題，手術治療也存在著病灶局部的復發(fā)以及骨缺損的問題。故一種能在病灶局部持續(xù)有效地釋放抗結核藥物，并能

2、修復骨缺損的一種載藥支架材料在骨結核的治療中尤為重要。目前研制的不同載藥支架，都存在著載藥單一、釋藥節(jié)律過快或過慢，以及材料無法降解、成骨能力差等問題。因此，研制出一種包埋多種藥物并能按照一定節(jié)律釋放的骨支架材料成為一大挑戰(zhàn)。載藥材料的選擇以及緩釋體系的設計是這一研究的關鍵。
　　有序介孔材料，由于比表面積和孔容較高，孔道結構規(guī)則有序、孔徑尺度在納米范圍、孔道表面易采用化學方法修飾以及生物相容性優(yōu)良等一系列優(yōu)點，在生物醫(yī)藥領域的藥

3、物載體方面具有較大的潛力。介孔生物活性玻璃(MBG)具有比傳統(tǒng)方法制備的生物玻璃更好的沉積羥基磷灰石的能力，作為具有良好生物活性的藥物載體得到廣泛研究。將MBG與高分子材料復合制備支架，不僅會克服純MBG無機支架過于脆弱的缺點，也可改善聚合物支架的生物活性和藥物輸送性能?；贛BG材料表現(xiàn)出的良好生物活性和藥物緩釋性能，可將其應用于載藥緩釋支架的構建。
　　三維打印(3D-Printing)技術可以在計算機輔助下，根據計算機輔助設

4、計(CAD)模型或者電子計算機斷層掃描(CT)數據，通過材料的精確堆積為臨床醫(yī)學量身定做特定生物材料制品。不同的材料及藥物可根據需要調整比例后通過粘合劑進行混合后方便打印，可適用的成型材料類型眾多，對于復雜空間結構的支架在制備上有其獨特優(yōu)勢，通過逐層打印、層層疊加可精確的控制支架的結構，設計出來的支架材料在生物力學強度及孔隙率方面在一定程度上可控。由于三維打印技術在支架材料的設計上具有打印生物材料種類多、打印精度高、集成化程度好和操作方

5、便等特點，在生物組織工程及藥物控釋方面得到廣泛應用。近年來關于三維打印技術用于制備MBG支架及其復合支架已有相關報道。
　　本研究針對骨結核術后局部骨缺損的修復及原位藥物化療的需要，采用三維打印技術設計制備裝載有異煙肼及利福平兩種抗結核藥物的MBG/PHBHHX（聚3-羥基丁酸-共-3-羥基己酸）復合支架。該支架中功能化后的不同孔徑和表面性質的MBG可區(qū)別裝載高量的一線抗結核藥異煙肼和利福平，介孔限域、表面化學基團以及PHBHHX

6、的逐步降解共同作用，實現(xiàn)盡可能長時間的藥物緩慢釋放。這種研究思路制備的載藥支架滿足聯(lián)合、高量及緩釋的臨床化療要求，不僅具有很高的科研學術價值，也具有重要的實際應用價值，有望為載藥緩釋支架研究提供新的發(fā)展，具有創(chuàng)新性。
　　實驗第一部分:載藥復合骨支架(DLCS)的制備與表征
　　目的:旨在通過三維打印技術制備MBG/PHBHHX載藥抗結核復合骨支架(DLCS)，采用TEM及SEM手段明確其形貌特征，并對其基本的理化性能及生物

7、學活性進行檢測。
　　方法:選擇三嵌段共聚物表面活性劑P123，采用揮發(fā)誘導自組裝方法，制備MBG粉體;在MBG的介孔孔道表面分別嫁接親水羧基和疏水甲基進行化學改性后用于擔載抗結核藥異煙肼和利福平;將載藥MBG粉體與PHBHHX配制成合適于打印的漿料后，置于三維打印機中制備出直徑為6mm，高為8mm的圓柱體復合載藥骨支架，命名為DLCS，同時采用浸滯法制備對照組載藥支架，命名為commercial Cap。應用掃描電鏡觀察分析復合

8、骨支架的晶相組成及微觀形貌，檢測支架的抗壓強度及孔隙率等理化性能，并通過檢測DLCS沉積羥基磷灰石的能力、成骨細胞粘附的能力及其對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響來評估DLCS的生物學活性。
　　結果:我們采用三維打印技術成功制備出了MBG/PHBHHx載藥復合骨支架，該支架材料的孔隙率為72.55±1.91(％)，發(fā)生20％行變時的平均抗壓強度為3.15±0.69MPa， SEM掃描顯示DLCS表面具有較多的孔隙，孔序分布均勻，孔

9、隙率較大，層與層之間排列緊密，結構穩(wěn)定。DLCS具有較好的沉積羥基磷灰石的能力，hBMSC細胞在支架表面黏附情況良好，ALP活性檢測顯示DLCS組與對照組差異不明顯(p＞0.05)，而較空白組的ALP活性低(p＜0.05)，這與其載藥后藥物的釋放對細胞的影響有關，但隨著天數的增加，實驗組及對照組中的ALP活性均出現(xiàn)明顯增強，說明DLCS仍具備良好的成骨性能。
　　結論:通過三維打印技術可成功制備MBG/PHBHHx載藥復合骨支架，

10、該支架具有較好的生物學活性，結構穩(wěn)定，能較好的裝載兩種抗結核藥物，且具有一定的抗壓強度，可為載藥人工骨支架的研究提供一種新的理論支持。
　　實驗第二部分:DLCS的體內外藥物釋放特性及其對肝腎功能影響的研究
　　目的:旨在檢測DLCS在體外模擬體液(SBF)及新西蘭大耳白兔體內的藥物釋放節(jié)律及特性，從而評估DLCS在藥物緩釋方面的性能，并檢測其在各不同時間段對動物機體肝腎功能的影響。
　　方法:取DLCS及對照組材料(

11、commercial Cap)各0.1g分別浸漬到20ml的SBF液后，置于恒溫振蕩器中。間隔相應時間段取樣并更換同體積SBF液。用HPLC檢測并計算每次所取介質INH、RFP的濃度，總結其在體外釋藥特性。DLCS及對照組材料各0.1g植入新西蘭大白兔的股骨下段骨缺損處，術后間隔相應時間段取靜脈血及材料植入處周圍組織，采用HPLC法檢測并計算對應INH和RFP的濃度，總結其在體內釋藥特性。間隔相應時間段對空白組、實驗組及對照組的肝腎功能

12、進行檢測，評價材料釋藥對動物肝腎功能的影響。
　　結果:體外模擬實驗顯示對照組INH及RFP兩種藥物的釋放量在第2w左右已接近100％，而實驗組INH和RFP分別在6w和4w左右釋放量接近80％，第10w仍未釋放完全。動物體內實驗顯示DLCS組局部濃度12w時仍在最低抑菌濃度(MIC:INH0.05μg/ml，RFP0.5μg/ml)之上，而對照組局部濃度4w時已降至最低抑菌濃度之下。血液中藥物濃度明顯低于材料周圍組織濃度，大部分

13、為5ug/ml以下。肝腎功能檢測結果顯示實驗組中谷丙轉氨酶(ALT)及谷草轉氨酶(AST)術后第7d及2w出現(xiàn)一過性升高，整個實驗過程中尿素氮(BUN)及肌酐(CR)值一直無明顯升高。
　　結論:DLCS載藥量滿意，體外及體內藥物緩釋節(jié)律均較對照組明顯緩慢，釋放性能穩(wěn)定，在體內局部組織中有效抑菌時間可達12w以上，可滿足骨結核術后局部化療的需要。DLCS的釋藥過程對新西蘭兔肝腎功能影響不大，僅對AST及ALT有一過性影響。

14、　　實驗第三部分:DLCS的生物安全性及成骨能力研究
　　目的:對DLCS的生物安全性進行評估，以證實其符合生物材料的應用標準;對DLCS的動物體內成骨性能進行檢測，以證實其修復骨缺損的能力。
　　方法:采用CCK-8法檢測DLCS的細胞毒性，并在動物體內行DLCS的急性全身毒性實驗、原發(fā)性皮膚刺激實驗、皮內刺激實驗和致敏實驗檢測，評價實驗材料的生物相容性和安全性。同實驗第二部分，建立兔股骨骨缺損模型，實驗組、對照組及空白組

15、各兩組，每組3只，術后6w及12w分批處死，大體觀察后，取骨缺損區(qū)域組織行Micro-CT掃描及硬組織切片檢查，研究DLCS對骨缺損的修復能力。
　　結果:CCK-8法檢測結果顯示各個時間段細胞的存活率CV均在80％以上，依據細胞毒性評價標準評估為1級，符合生物材料使用標準。動物急性全身毒性實驗、原發(fā)性皮膚刺激實驗、皮內刺激實驗和致敏實驗均顯示DLCS毒性較低，與機體具有較好的生物相容性，生物安全性良好。在兔股骨骨缺損修復過程中，