甲基化修飾的WIF1對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控及在子癇前期中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：檢測(cè)WIF1（Wnt inhibitory factor1）在正常早孕期絨毛組織、蛻膜組織的表達(dá)和定位；研究WIF1在調(diào)控人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲中的作用和可能的機(jī)制；探討WIF1在滋養(yǎng)細(xì)胞功能調(diào)控中的相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步明確相關(guān)分子機(jī)制；比較子癇前期和正常胎盤組織中WIF1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，探討WIF1甲基化在子癇前期發(fā)病中的可能作用機(jī)制。
　　方法：（1）免疫組化和Western blotting(WB)檢測(cè)人早孕期絨毛和蛻

2、膜組織中 WIF1、Wnt5a和β-catenin蛋白的表達(dá)。(2)利用慢病毒載體，通過基因過表達(dá)和RNA干擾技術(shù)，增加和敲除絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo和早孕絨毛外植體的 WIF1基因表達(dá)。(3)采用 Western blotting檢測(cè)干擾效率。(4)采用Western blotting檢測(cè)Cyclin D1表達(dá)，碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色檢測(cè)細(xì)胞周期，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖。Annexin V-

3、PE/7-AAD染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。(5)采用 Western blotting檢測(cè)整合素β1、N-cadherin和E-cadherin的表達(dá)。(6) Transwell小室和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WIF1對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力的調(diào)控。(7)明膠酶譜法檢測(cè) HTR8/SVneo細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的活性，Western blotting檢測(cè)基質(zhì)金屬

4、蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)蛋白表達(dá)水平。（8）Western blotting檢測(cè)WIF1對(duì)β-catenin和Wnt5a的表達(dá)影響。（9）免疫共沉淀檢測(cè)WIF1與Wnt3a和Wnt5a的作用。（10）用重組 Wnt5a蛋白培養(yǎng) HTR8/SVneo，采用 Western blotting檢測(cè)β-catenin、整合素β1、α5和 N-cadherin的表

5、達(dá)。（11）激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)重組Wnt5a對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞鈣離子濃度的影響，進(jìn)一步明確WIF1調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能的相關(guān)信號(hào)通路。（12）運(yùn)用甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)定性分析和亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR, BSP）定量檢測(cè)比較WIF1在子癇前期和正常胎盤組織中的甲基化狀態(tài)，Western blotting檢測(cè) DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl

6、transferase, DNMTs)的表達(dá)，甲基化抑制劑處理滋養(yǎng)細(xì)胞后檢測(cè)WIF1的表達(dá)，探討WIF1甲基化在子癇前期發(fā)病中的作用及可能機(jī)制。
　　結(jié)果：（1）WIF1和 Wnt5a在合體滋養(yǎng)細(xì)胞（syncytiotrophoblast, STB）、滋養(yǎng)細(xì)胞柱（ trophoblast column, TC）及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（cytotrophoblast, CTB）胞漿中均有較高表達(dá)；β-catenin在STB、TC及 CTB胞

7、漿中均表達(dá)，但在 CTB中的表達(dá)高于其他細(xì)胞。WIF1和Wnt5a在母體蛻膜CTB及腺上皮、間質(zhì)細(xì)胞中亦有表達(dá)。β-catenin在蛻膜CTB中的表達(dá)要高于母體蛻膜細(xì)胞。WIF1和Wnt5a在蛻膜組織中的總體蛋白水平高于絨毛組織，而β-catenin在蛻膜中的的總體蛋白水平低于絨毛組織。（2）WIF1促進(jìn)HTR8/SVneo細(xì)胞增殖和凋亡。（3）過表達(dá) WIF1抑制 HTR8/SVneo細(xì)胞和絨毛外植體整合素β1和E-cadherin的

8、表達(dá)，促進(jìn)HTR8/SVneo細(xì)胞N-cadherin的表達(dá)。（4）過表達(dá)WIF1可以通過增加MMPs的活性、抑制TIMPs的表達(dá)來促進(jìn)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲能力。（5）WIF1在HTR8/SVneo細(xì)胞中直接和Wnt3a和Wnt5a結(jié)合，激活β-catenin，促進(jìn)Wnt5a的表達(dá)。（6）重組Wnt5a抑制HTR8/SVneo細(xì)胞整合素β1、α5和N-cadherin的表達(dá)。（7）重組Wnt5a激活滋養(yǎng)細(xì)胞中的鈣信號(hào)。（8）WIF1

9、在子癇前期的胎盤組織和正常早期、晚孕期胎盤組織中均有甲基化，但甲基化程度不高，正常足月胎盤組織的甲基化程度比子癇前期的足月胎盤組織和正常早期胎盤組織稍高，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（9）WIF1的蛋白在子癇前期胎盤組織中的表達(dá)存在個(gè)體差異，總體水平低于正常胎盤組織，但無顯著性差異。(10) DNMTs在子癇前期胎盤組織中表達(dá)均顯著降低。(11)甲基化抑制劑可以顯著提高滋養(yǎng)細(xì)胞株 JEG3和HTR8/SVneo的WIF1的表達(dá)，說明WIF1的

10、表達(dá)受甲基化調(diào)控。
　　結(jié)論：(1) WIF1通過調(diào)控 MMPs的活性和整合素、鈣黏蛋白和TIMPs的表達(dá)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，是胎盤發(fā)育過程中的重要調(diào)控因子
　　(2) WIF1在滋養(yǎng)細(xì)胞中可以激活β-catenin信號(hào)，并與Wnt5a相互作用，后者可抑制 HTR8/SVneo細(xì)胞β-catenin、整合素β1、α5和N-cadherin的表達(dá)，說明Wnt信號(hào)通路在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲中的調(diào)控作用。
　　(3) WIF1的