UT-B基因敲除小鼠腦中精氨酸酶Ⅰ的表達(dá)變化及炎癥反應(yīng)的發(fā)生.pdf

1、目的：研究尿素通道蛋白B（Urea transporter B，UT-B）基因敲除小鼠腦中精氨酸酶Ⅰ（ArginaseⅠ, ArgⅠ）的表達(dá)變化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生及可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法觀察野生型小鼠腦中精氨酸酶I的分布情況；免疫熒光法觀察野生型小鼠和UT-B基因敲除小鼠腦組織中精氨酸酶I與神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)特點(diǎn)；蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)UT-B基因敲除小鼠和

2、野生型小鼠腦中ArgⅠ、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factorα，TNF-α）蛋白的表達(dá)變化。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M UT-B基因敲除小鼠腦中尿素堆積，利用高濃度(25 mmol/L)尿素刺激人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMECs)

3、，免疫熒光法觀察細(xì)胞內(nèi)TNF-α和iNOS的表達(dá)；Western blot檢測(cè)高濃度尿素刺激細(xì)胞3、6、12和24h后，炎癥因子iNOS、TNF-α、環(huán)氧合酶-2（Cycloxygenase-2，COX-2）和相關(guān)信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子蛋白（nuclear factor kappa B，NF-κB/p65）、p-p65、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK的蛋白表達(dá)水平變化；

4、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和化學(xué)法進(jìn)一步檢測(cè)高濃度尿素在不同時(shí)間刺激人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞后TNF-α和NO的含量。
　　結(jié)果：
　　1.精氨酸酶Ⅰ在小鼠腦組織中分布廣泛，包括大腦皮質(zhì)（分子層除外）、海馬（主要表達(dá)在CA1、CA3亞區(qū)及齒狀回）、丘腦（核團(tuán)）、腦干神經(jīng)核團(tuán)、小腦（核團(tuán)及皮質(zhì)的顆粒細(xì)胞層和梨狀細(xì)胞層）、第三腦室和脈絡(luò)叢等。ArgⅠ陽性表達(dá)產(chǎn)物主要在神經(jīng)元的胞體和樹突，少量表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.與野生

5、型小鼠相比，UT-B基因敲除小鼠腦組織中標(biāo)記神經(jīng)元的NeuN陽性熒光強(qiáng)度明顯減弱。
　　3.與野生型小鼠相比，UT-B基因敲除小鼠海馬中ArgⅠ蛋白表達(dá)水平下降（P<0.05），而iNOS和TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）。
　　4.高濃度(25mmol/L)尿素刺激人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞中TNF-α、COX-2、p-p65和p-AMPK蛋白表達(dá)水平在3和6h明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；iNOS

6、蛋白表達(dá)水平在24h內(nèi)則持續(xù)增高（P<0.05）；NO含量在3h明顯增多（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.野生型小鼠腦組織中精氨酸酶I分布廣泛，且主要表達(dá)在神經(jīng)元上，少量表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.UT-B基因敲除小鼠與野生型小鼠比較，腦組織中神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，且精氨酸酶I含量隨神經(jīng)元數(shù)目減少而減少。除此之外，UT-B基因敲除小鼠腦組織中相關(guān)炎癥因子iNOS和 TNF-α蛋白表達(dá)水平增高，提示UT-B基因敲除