脂質自噬在BPA所致肝臟脂質沉積中的作用研究.pdf

1、目的：環(huán)境內分泌干擾物雙酚A（Bisphenol A，BPA）可促進肝臟脂質沉積，但其機制尚不清楚。而脂質自噬減弱可導致肝臟脂質沉積的發(fā)生，其是否介導BPA所致的肝臟脂質沉積，目前尚不清楚，本研究通過體內外模型揭示脂質自噬在BPA所致肝臟脂質沉積中的作用。
　　方法：在體外實驗中，將HepG2細胞分為對照組、BPA不同濃度（1、0.001、1、4、10μM）干預組、陽性對照組即200μM油酸（Oleic acid，OA）聯合400

2、μM軟脂酸（Palmitic acid，PA）。分別給予上述不同干預24h。采用化學酶促-比色法定量檢測細胞內甘油三酯（Triglyceride，TG）含量，油紅O及Bodipy493/503熒光染色觀察細胞內脂滴，以明確體外脂質沉積模型構建是否成功。Real-time PCR及Western blot、免疫熒光等方法檢測在不同干預情況下HepG2細胞內與自噬相關的指標LC3、P62的表達水平，透射電鏡觀察自噬體數量，并對自噬的各個階段

3、進行分析：①自噬的啟動階段：Western blot等方法檢測p-mTOR、p-ULK1、Atg5表達水平；②自噬體與溶酶體融合階段：免疫熒光檢測LC3與LAMP1共定位；③溶酶體降解階段：AO染色檢測溶酶體酸度、Calthepsin L表達水平。進一步用10μM BPA干預原代肝細胞，對上述部分關鍵結果進行驗證。在體內實驗中，分別用不同濃度BPA（5、50、500μg/kg/day）喂養(yǎng)CD1小鼠42天后，檢測肝臟脂質沉積，從體內驗證

4、脂質沉積模型是否成功建立，并進一步對自噬相關指標進行檢測，從體內對體外相關結果進行驗證。
　　結果：體外HepG2肝細胞及原代肝細胞中：1、不同濃度干預后，細胞內TG含量不同程度增加，其中10μM BPA組升高具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。油紅O染色及Bodipy493/503脂滴染色結果與TG結果一致。2、Western blot及免疫熒光結果顯示，與對照組相比，10μM BPA干預后 LC3-Ⅱ的表達明顯增加，同時與自噬降解

5、關系密切的蛋白 P62表達亦增加，加用抑制劑CQ阻斷自噬體降解后，BPA組LC3-Ⅱ的表達較單用CQ組降低，自噬通量受損。透射電鏡觀察到10μM BPA組自噬體數量堆積。3、對自噬過程的各個階段進行檢測后發(fā)現：a、啟動階段：10μM BPA干預后p-ULK1、p-mTOR表達增加，Atg5表達減少（p<0.05）；b、融合階段：10μM BPA干預后LC3與LAMP1融合減少；c、溶酶體降解階段：與對照組相比，10μM BPA干預組AO

6、染色熒光小點明顯減少，溶酶體酸度明顯減弱；Cathepesin L蛋白表達減少（p<0.05）。體內試驗中，與對照組相比，50、500μg/kg/day BPA干預組 CD1小鼠肝臟中 TG含量明顯增加（p<0.05），油紅O染色結果與TG結果一致；與對照組相比，BPA500組LC3-Ⅱ表達、P62表達明顯增加，Cathepesin L蛋白表達減少（p<0.05）。
　　結論：在體內與體外實驗中，我們發(fā)現BPA可導致肝臟脂質沉積，