胎盤細胞的分離培養(yǎng)及其與母血、臍血細胞嵌合情況的研究.pdf

1、近年來，干細胞由于其自我更新及多向分化潛能的雙重特性，在再生醫(yī)學、細胞替代治療及藥物篩選等領域顯示出了廣闊的應用前景。并且隨著干細胞以及組織工程相關基礎及臨床研究的深入，已經(jīng)在一部分疾病中顯示出了良好的治療效果。但當代醫(yī)學中，仍然存在著許多以目前醫(yī)療水平所不能徹底治愈的疾病，其中有一部分有關細胞、組織甚至器官的壞死如糖尿病、免疫功能障礙、阿爾茲海默病及帕金森等。干細胞的出現(xiàn)及逐漸深入研究，也為這些疾病的治愈帶來的嶄新的希望。目前干細胞的

2、主要來源及潛在來源包括胚泡，胎兒組織，臍帶血及成人組織。在諸多種類干細胞的臨床試驗及應用中，造血干細胞移植的理論基礎和技術方法相對較成熟。造血干細胞移植目前對于大多數(shù)惡性血液系統(tǒng)腫瘤及一些免疫缺陷病是很有潛力的一種根治性治療方法，在臨床上已有廣泛的應用。造血干細胞移植主要包括自體移植和異體移植兩種方式。在造血干細胞的來源方面，過去比較成熟理想的來源為骨髓及外周血，但其來自于成體因而干性較弱。研究者們一直在堅持不懈的尋找更為理想并容易獲得

3、的細胞來源。20世紀80年代起，臍血因其豐富的造血干細胞含量吸引了研究者們的注意。臍血來源干細胞在臨床上的應用迅速發(fā)展，在造血重建及免疫系統(tǒng)重建方面有較理想的效果，擴展了造血干細胞的來源。臍血干細胞來源豐富且免疫原性較低，但單份臍血含的細胞數(shù)量較少限制了其臨床應用范疇。因此，找到更加廣泛，更加適合的細胞來源成為造血干細胞移植臨床應用的突破口。
　　胎盤為圓盤形，嵌于子宮壁中，是孕期支持胎兒和母體之間進行各種物質交換并兼具內(nèi)分泌等功

4、能的器官，由底蛻膜、葉狀絨毛膜和羊膜三部分組成。通常，胎盤屬于分娩過程中所產(chǎn)生的廢棄物，然而近年來由于許多研究發(fā)現(xiàn)多種干、祖細胞存在于胎盤中，即胎盤本身便是一個含量豐富的干、祖細胞庫，因而受到越來越多的關注和探索。大量細胞組群的存在顯示出其在未來再生醫(yī)學臨床應用中的巨大潛能。研究顯示胎盤中含有許多不同種類的干細胞，近些年來，諸多研究的主要方向及重點針對于其所含間充質干細胞方面，對于造血干細胞相關的發(fā)掘研究較少?；谝延械膶嶒炑芯考跋嚓P結

5、果，我們可以推斷，對胎盤來源的細胞加以更為深入和細致的研究，充分了解其生物學特性，對于選擇和促進其盡早應用于臨床有著至關重要的作用，可以解決臨床多種相關疾病干細胞來源短缺或不合的問題。并且胎盤來源的細胞較體細胞而言，更為原始干性更強，可能獲得更優(yōu)的臨床療效。
　　本研究的主要目的即為檢測胎盤中單個核細胞總數(shù)以及CD34+細胞數(shù)量并與單份臍血中細胞數(shù)量做比較，觀察胎盤及臍血來源細胞的集落形成情況，分別檢測胎盤來源細胞、母血來源細胞和

6、臍血來源細胞的HLA型別，應用STR-PCR技術檢測和探索胎盤來源細胞與母血、臍血細胞的嵌合程度，為今后應用于臨床提供相關理論基礎。本研究主要分以下兩部分內(nèi)容:
　　1.胎盤和臍血中細胞總數(shù)及其中CD34+細胞所占比例研究。胎盤及臍血來源細胞在體外接種培養(yǎng)的集落形成情況。
　　在產(chǎn)婦及其家屬知情同意并簽署知情同意書的前提下，在研究獲得解放軍307醫(yī)院倫理委員會審批的情況下，我們收集了五位健康足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的臍血及其對應胎盤。

7、分娩過程中將臍血抽出置入一次性塑料血袋暫時保存，取回后離心并取下層細胞計數(shù)。胎盤用生理鹽水反復沖洗以去除其表面殘存血液及雜質，用注射器推注并收集胎盤脈管中的血液，應用含有10g/L AMD3100的生理鹽水灌注胎盤脈管系統(tǒng)，夾閉臍動脈并孵育30分鐘，收集灌注液，胎盤脈管中血液及灌注液離心并取下層細胞計數(shù)。胎盤剩余組織部分用剪切加酶消化法、研磨法處理，由100目鋼網(wǎng)過濾，反復沖洗離心后計細胞數(shù)。將胎盤脈管血液、灌注液及組織來源的細胞計總數(shù)

8、。
　　用流式細胞儀檢測臍血來源細胞及胎盤來源細胞中CD34+細胞的數(shù)量及所占比例。以5×104將臍血來源及胎盤來源細胞分別添加進1.1mL培養(yǎng)基中并接種于培養(yǎng)皿，于含5％CO2的培養(yǎng)箱中以37℃培養(yǎng)并定期觀察。
　　實驗結果顯示，胎盤中所獲取的細胞總數(shù)、CD34+細胞數(shù)及其所占比例均明顯高于從臍血所獲取的細胞數(shù)。胎盤和臍血的集落培養(yǎng)皿均在接種后第六天可以觀察到集落的出現(xiàn)，第十四天可以觀察到集落形成良好。但與臍血細胞相同的接

9、種密度下，胎盤來源細胞所形成的集落數(shù)量較少。胎盤中所含細胞數(shù)量上明顯的優(yōu)勢提示我們，胎盤可能是未來臨床干細胞移植治療各類疾病很有潛力的來源。集落形成實驗部分顯示胎盤來源細胞具有多種集落形成的能力，而集落形成能力是造血干祖細胞分化以及增殖潛能的一項重要評估內(nèi)容。
　　2.胎盤來源細胞的HLA檢測及其與母血、臍血來源細胞嵌合的檢測。
　　于產(chǎn)婦進入產(chǎn)房前自貴要靜脈抽取外周血5mL，離心后取下層細胞。分別檢測胎盤來源細胞、母血細胞

10、及臍血細胞的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1位點。HLA檢測結果顯示本研究五例樣本中有兩例胎盤細胞HLA位點檢測提示其含有母體成分，其余三例結果顯示胎盤來源細胞與臍血細胞位點完全相合。STR-PCR方法檢測嵌合率的結果顯示五例胎盤樣本中均有母體成分嵌合，而HLA檢測提示有母體成分的兩例母體成分嵌合率尤其高。因此我們推斷，HLA檢測結果不同可能與其檢測靈敏度及胎盤組織根據(jù)解剖結構肉眼分離有偏差相關，但

11、與STR檢測結果綜合考慮提示，就目前的分離方法，胎盤中確實混有母體來源的成分，而其是否對臨床移植的效果產(chǎn)生影響，還需要進一步的研究。
　　本研究的創(chuàng)新性在于系統(tǒng)并完整的將臍血、胎盤和母血來源細胞以同樣的檢測方法檢測，并得出可以對比并有一定意義的檢測結果。同時，將HLA檢測和STR-PCR檢測方法共同應用于檢測胎盤細胞來源及其與母體成分和胎兒成分嵌合的探索研究中，更加精準的檢測出微小的嵌合比率，為潛在的臨床應用可行性及方法的選擇及奠