版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
本研究的主要目的旨在明確Robo4、TUG1在調(diào)節(jié)BTB通透性和膠質(zhì)瘤血管新生的可能作用和相關(guān)機(jī)制,為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路和作用靶點(diǎn)。
方法:
1.應(yīng)用Real-time PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Robo4在正常人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮(GEC)中的表達(dá)和定位。
2.構(gòu)建體外血腫瘤屏障模型,利用穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默人腦微血管
2、內(nèi)皮細(xì)胞建立相應(yīng)的體外BTB模型。
3.跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻檢測(cè)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)滲透實(shí)驗(yàn),明確Robo4表達(dá)變化后對(duì)BTB通透性的影響。
4.給予Robo4激活性配體Slit2N預(yù)處理24小時(shí)后,檢測(cè)跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻和HRP滲透實(shí)驗(yàn),明確Robo4激活性配體Slit2N在Robo4調(diào)控BTB通透性中的作用。
5.應(yīng)用Western blot和細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的人腦
3、微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立的體外BTB模型中內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá)變化。
6.應(yīng)用Western blot和明膠酶譜法檢測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立的體外BTB模型的內(nèi)皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性變化。
7.給予基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001預(yù)處理24小時(shí)后,檢測(cè)跨內(nèi)皮細(xì)胞阻和HRP滲透實(shí)驗(yàn),明確基質(zhì)金屬
4、蛋白酶MMP-2、MMP-9在Robo4調(diào)控BTB通透性中的作用,Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9在Robo4調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá)過(guò)程中的作用。
8.應(yīng)用Western blot檢測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立的體外BTB模型的內(nèi)皮細(xì)胞中Robo4相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)因子(Src、Erk1/2)的表達(dá)和磷酸化水平變
5、化。
9.給予Src抑制劑PP2(抑制Tyr-416磷酸化位點(diǎn))和Erk1/2抑制劑PD98059(抑制Erk1/2磷酸化)預(yù)處理24小時(shí)后,跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻和HRP滲透實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BTB模型通透性變化,Western blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5表達(dá)變化,應(yīng)用Western blot和明膠酶譜法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性變化。
10.采用膠質(zhì)
6、瘤條件培養(yǎng)方法,通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)、Matrigel tube體外血管形成實(shí)驗(yàn),明確膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、體外成血管能力的影響。
11.穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)、Matrigel tube體外血管形成實(shí)驗(yàn),研究Robo4表達(dá)變化對(duì)膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、體外成血管能力的影響。
7、
12.分別給予Robo4激活性配體Slit2N和(或)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF-165,明確Slit2N和VEGF-165在Robo4調(diào)控的膠質(zhì)瘤血管新生中的作用。
13.應(yīng)用Western blot檢測(cè)膠質(zhì)瘤微環(huán)境下過(guò)表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Robo4相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)因子(VEGFR2、PI3K、AKT、FAK)的表達(dá)和磷酸化水平變化。
14.膠質(zhì)瘤微環(huán)境下的Ro
8、bo4表達(dá)沉默的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,分別給予VEGFR2抑制劑SU-1498,AKT抑制劑LY294002和FAK抑制劑FAK inhibitor14預(yù)處理24小時(shí)后,檢測(cè)對(duì)膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、體外成血管能力的影響。
15.激光捕獲顯微切割獲得正常人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞,Real-time PCR、原位雜交法檢測(cè)正常人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮中TUG1的表達(dá)和定位。
結(jié)果:
9、1.Robo4在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá),且在人膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。
2.成功建立了人血腫瘤屏障體外模型,并成功構(gòu)建了基于穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Robo4和Robo4表達(dá)沉默的血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建的相應(yīng)的體外血腫瘤屏障模型。
3.內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)Robo4使BTB模型TEER值顯著增高,HRP滲透率顯著降低;Robo4表達(dá)沉默使BTB模型的TEER值顯著降低,HRP滲透率顯著增高。
4.Robo4的表達(dá)變
10、化改變BTB通透性的過(guò)程中,是通過(guò)配體Slit2與Robo4結(jié)合起作用的。
5.內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)Robo4使緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá)顯著增加;內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默使緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá)顯著減少,由連續(xù)分布變?yōu)椴贿B續(xù)分布。
6.內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)Robo4使MMP-9的表達(dá)和活性顯著降低;內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默使MMP-9的
11、表達(dá)顯著上調(diào),活性顯著增加。而基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達(dá)和活性未見(jiàn)顯著改變。
7.基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001預(yù)處理部分阻斷了Robo4表達(dá)沉默對(duì)BTB通透性和緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)的影響。
8.內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)Robo4使內(nèi)皮細(xì)胞Src和Erk1/2的磷酸化水平顯著降低;內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默使內(nèi)皮細(xì)胞Src和Erk1/2的磷酸化水平顯著升高。
9.Src抑制劑PP2和E
12、rk1/2抑制劑PD98059部分阻斷了Robo4表達(dá)沉默對(duì)BTB通透性和緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5表達(dá)的影響,同時(shí)部分阻斷Robo4表達(dá)沉默導(dǎo)致的MMP-9的活性和表達(dá)增加的作用效果。
10.膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,增強(qiáng)其體外成血管能力。
11.內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Robo4抑制膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和體外成血管。
12.內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)Robo4使內(nèi)皮細(xì)
13、胞VEGFR2、PI3K、AKT和FAK磷酸化水平顯著下調(diào),內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默使內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2、PI3K、AKT和FAK磷酸化水平顯著上調(diào)。Robo4抑制膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2介導(dǎo)的PI3K/AKT和FAK信號(hào)通路的激活。
13.VEGFR2抑制齊劑 SU-1498、AKT抑制齊劑 LY294002、FAK抑制齊劑 FAK inhibitor14部分阻斷了Robo4抑制膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)下的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移
14、和形成血管的作用。
14.TUG1在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)。沉默TUG1降低GEC緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá),增加BTB通透性。
15.MiR-144在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-144降低GEC緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá),增加BTB通透性。
16.TUG1與miR-144存在靶向結(jié)合作用。
15、結(jié)論:
1.Robo4在正常人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在內(nèi)源性表達(dá),在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)。
2.膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞Robo4表達(dá)沉默能夠顯著降低緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1、claudin-5的表達(dá),增加BTB通透性,其機(jī)制是通過(guò)激活Src-Erk1/2信號(hào)通路,增加MMP-9的表達(dá)和活性實(shí)現(xiàn)。
3.Robo4的表達(dá)變化改變BTB通透性的過(guò)程中,是通過(guò)配體Slit2與Robo4
16、結(jié)合發(fā)揮作用。
4.Robo4通過(guò)抑制VEGFR2介導(dǎo)的PI3K-AKT和FAK信號(hào)通路的激活,進(jìn)而發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和體外成血管的作用。
5.TUG1、miR-144、HSF2在正常人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在內(nèi)源性表達(dá),TUG1和HSF2在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá),miR-144在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)。
6.膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞TUG1表達(dá)沉默通過(guò)上調(diào)miR-144的表達(dá),顯
17、著降低緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá),增加BTB通透性。
7.膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-144過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子HSF2并下調(diào)其表達(dá),進(jìn)而降低緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá),增加BTB通透性。
8.轉(zhuǎn)錄因子HSF2與緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,增加其啟動(dòng)子活性。
9.TUG
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 地塞米松對(duì)膠質(zhì)瘤性腦水腫及血腫瘤屏障通透性影響機(jī)制的研究.pdf
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能及機(jī)制研究.pdf
- 家蠶神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子Robo的功能研究.pdf
- 軸突導(dǎo)向因子netrin-1及其受體家族在角膜血管新生中的導(dǎo)向作用.pdf
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOXC-AS1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及機(jī)制研究.pdf
- 軸突導(dǎo)向因子Netrins對(duì)角膜新生血管和炎癥的作用研究.pdf
- 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)血腫瘤屏障通透性的影響及作用機(jī)制初探.pdf
- MicroRNA-34c對(duì)血腫瘤屏障通透性和膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制研究.pdf
- 敲減長(zhǎng)鏈非編碼RNA ATB抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲.pdf
- 軸突導(dǎo)向因子Netrin-1在肺癌血管擬態(tài)和血管新生中的作用及機(jī)制的初步研究.pdf
- 角膜新生血管相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)的鑒定及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf
- 異常表達(dá)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在腦膠質(zhì)瘤中的功能研究.pdf
- 槲皮素對(duì)膠質(zhì)瘤大鼠血腦屏障通透性的影響.pdf
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA DILC在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能初探.pdf
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1、GAS5在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)差異的研究.pdf
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA-TSLC1-AS1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能研究.pdf
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA-MIAT在眼部神經(jīng)和血管功能異常過(guò)程的調(diào)控作用研究.pdf
- 微血管通透性與腦膠質(zhì)瘤分級(jí)之間定量關(guān)系的研究.pdf
- Shh-Ptch1-Smo信號(hào)通路調(diào)控上行5-HT神經(jīng)軸突導(dǎo)向.pdf
- 內(nèi)皮-單核細(xì)胞激活多肽Ⅱ選擇性增加血腫瘤屏障通透性的作用和機(jī)制.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論