太平洋磷蝦（Euphausia pacifica Hansen）胰蛋白酶樣酶酶學(xué)性質(zhì)及基因片段研究.pdf

1、本文通過分離純化太平洋磷蝦胰蛋白酶樣酶，對其相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。并克隆其基因進(jìn)行序列分析，探討其酶學(xué)性質(zhì)的分子機(jī)理。以期為胰蛋白酶樣酶的理論研究及其醫(yī)學(xué)、工業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 采用雙向電泳及生物大分子質(zhì)譜技術(shù)，在太平洋磷蝦粗酶內(nèi)內(nèi)鑒定到至少兩種胰蛋白酶樣酶。太平洋磷蝦蛋白酶粗酶經(jīng)35～65％飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析，Sephadex G100凝膠過濾層析以及Benz

2、amidine-Sepharose 4B親和層析得到兩種胰蛋白酶樣酶，TLE Ⅰ和TLE Ⅱ，相對分子量分別為32.9和32.3 kDa。TLE Ⅰ比活力為91.4 BApNA單位每毫克蛋白，純化倍數(shù)為177；TLE Ⅱ比活力為113 BApNA單位每毫克蛋白，純化倍數(shù)為218。 兩種酶促反應(yīng)的速率受pH、溫度影響。在37℃，以BApNA為底物的反應(yīng)體系中，在較廣泛的pH范圍(6.0～11.0)內(nèi)，酶具有較高活力，最適宜反應(yīng)pH

3、在9.0～10.0之間；在pH 9.0，以BApNA為底物的反應(yīng)體系中，酶在較廣泛的溫度范圍(20～70℃)內(nèi)具有較高活力，反應(yīng)最適宜溫度為40℃～50℃。 兩種胰蛋白酶樣酶在低于40℃溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，在高于40℃時(shí)穩(wěn)定性降低。 Mg<'2+>和Ca<'2+>對兩種胰蛋白酶樣酶有一定的激活作用，Zn<'2+>、Cu<'2+>、pb<'2+>：Hg<'2+>對兩種酶活力均有一定抑制作用，其中pb<'2+>和Hg<'2+

4、>對兩種酶表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制。 乙醇、丙三醇和二甲亞砜在低濃度時(shí)對兩種胰蛋白酶樣酶活力無明顯影響，高濃度下表現(xiàn)為強(qiáng)烈抑制作用；丙酮對兩種酶有較強(qiáng)烈的抑制作用。 絲氨酸蛋白酶專一性抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)以及胰蛋白酶專一性抑制劑對氨基苯甲脒(p-amionbenzamidine)、雞卵類粘蛋白(CEOM)、苯甲脒(benzamidine)、N-對甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲酮(TLCK)對兩種

5、胰蛋白酶樣酶具不同程度抑制作用，胰凝乳蛋白酶專一性抑制劑N-對甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲酮(TPCK)對兩種胰蛋白酶樣酶無抑制作用。 證明這兩種酶是胰蛋白酶，屬于絲氨酸蛋白酶家族。 TLE Ⅰ的米氏常數(shù)K<,m>=0.088 mmol L<'-1>；催化常數(shù)(轉(zhuǎn)換數(shù))K<,cat>=0.84 S-1；表觀二級(jí)速率常數(shù)(專一性常數(shù)，轉(zhuǎn)換效率)K<,cat>/K<,m>=9.54 mmol L<'-1>S<'-1>；TLE Ⅱ的K<

6、,m>=0.064 mmol L<'-1>；催化常數(shù)(轉(zhuǎn)換數(shù))K<,cat>=0.98 S<'-1>；表觀二級(jí)速率常數(shù)(專一性常數(shù)，轉(zhuǎn)換效率)K<,cat>/K<,m>=15-3 mmol L<'-1>S<'-1>。TLE的K<,cat>/K<,m>較某些生物胰蛋白酶高1.6-6.7倍。 Benzamidine對TLE Ⅰ的抑制類型為非競爭性抑制，抑制劑常數(shù)K<,i>=0.07 mmolL<'-1>。 組氨酸殘基、色氨酸

7、殘基是構(gòu)成TLE Ⅰ酶活性中心的必需基團(tuán)。精氨酸殘基可能是該酶活性中心結(jié)合部位的關(guān)鍵基團(tuán)。賴氨酸的游離￡一氨基與酶活性有關(guān)，巰基可能與酶活性相關(guān)。游離羧基不是TLE Ⅰ活性中心的必需功能基團(tuán)。 太平洋磷蝦、南極大磷蝦、中國毛蝦、中國明對蝦、刀額新對蝦、脊尾白蝦、日本蟳、三疣梭子蟹、中華絨螯蟹等九種甲殼動(dòng)物胰蛋白酶基因基因結(jié)構(gòu)基本一致。至少有三個(gè)基因家族，各家族間第二個(gè)內(nèi)含子有13.2～66.1％相似度，基因間有65.9～90％相

8、似度；各家族內(nèi)部的第二個(gè)內(nèi)含子有1.9～6.2％的變異，基因間有2.5～6.7％變異。 接觸反應(yīng)三聯(lián)體(His<,30>-Asp<,82>-Ser<,189>)是保守的，底物結(jié)合位點(diǎn)Asp<,193>、鹽鍵形成位點(diǎn)Asp<,188>以及二硫鍵形成位點(diǎn)Cys<,15>、Cys<,31>、CyS<,118>(昆蟲缺失)、Cys<,151>、Cys<,172>、Cys<,184>、Cys<,194>(昆蟲缺失)在絕大多數(shù)物種中也較保守

9、，形成4個(gè)二硫鍵(昆蟲只有三個(gè))。 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明物種進(jìn)化過程中，胰蛋白酶基因分化與演進(jìn)過程可能與物種分化與演進(jìn)的過程并不完全一致。 甲殼動(dòng)物胰蛋白酶極性氨基酸如精氨酸、賴氨酸含量較低，Arg/(Arg+Lys)比值較低；天冬氨酸、谷氨酸含量較高；非極性氨基酸如異亮氨酸含量較高，而甲硫氨酸、脯氨酸含量較低。這些可能也是甲殼動(dòng)物對環(huán)境理化因子及餌料成分、豐度多變的一種適應(yīng)。在上述條件下甲殼動(dòng)物演化出pH、溫度穩(wěn)定性較低