髓系腫瘤細(xì)胞中ASXL1基因突變及組蛋白乙?；惓z測的臨床意義.pdf

1、目的：隨著對白血病等惡性血液病發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)越來越多的白血病細(xì)胞具有特定的非隨機(jī)性染色體畸變，導(dǎo)致染色體上的相關(guān)基因重排、缺失、融合和鑲嵌，而許多涉及基因則可以編碼某些重要的轉(zhuǎn)錄因子或其他細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和信號通路蛋白等。近年來表觀遺傳學(xué)概念的引入，發(fā)現(xiàn)像組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子自身的修飾與染色質(zhì)構(gòu)型重塑等這些表觀遺傳學(xué)表現(xiàn)形式，對造血相關(guān)的基因表達(dá)與調(diào)控有著重要作用，使人們對白血病等惡性血液病的發(fā)病分子機(jī)制的認(rèn)識有了更深入的

2、了解。
　　ASXL1（additional sex-comb like-1）屬于ASXL家族（ASXL1，ASXL2，ASXL3）成員之一，位于染色體20q11上,是Trithorax與Polycomb家族的增強(qiáng)子，對于維持基因表達(dá)穩(wěn)態(tài)中有著關(guān)鍵作用。曾有研究表明，在對維甲酸（RA）敏感的腫瘤細(xì)胞中，ASXL1蛋白在SRC-1的協(xié)同作用下，可以募集更多的乙酰化組蛋白H3在RA敏感的啟動子區(qū)域，因此ASXL1蛋白的穩(wěn)定表達(dá)對內(nèi)源性

3、RA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)有增強(qiáng)作用。相反，另一方面在對于RA抵抗的細(xì)胞腫瘤系中，ASXL1又可以成為RA受體的協(xié)同抑制因子。這些研究都支持ASXL1具有激活和抑制的雙重作用。Gelsi-Boyer等在MDS病人中利用比較基因組雜交芯片第一次發(fā)現(xiàn)了ASXL1基因的突變，隨后在越來越多的髓系腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了ASXL1基因的突變。
　　在表觀遺傳學(xué)的眾多形式中,組蛋白乙?；c去乙?；亲钪匾男揎椃绞?，基因的表達(dá)與調(diào)控很大程度上是由它們共同驅(qū)使

4、，這種可逆的動態(tài)修飾由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HATs）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs）共同催化,共同控制染色質(zhì)各區(qū)域核心組蛋白的乙?；潭?。HATs/HDACs對基因調(diào)控有著重要影響，當(dāng)它們的功能失調(diào)時，會引起惡性腫瘤的發(fā)生。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，像一些對于造血細(xì)胞分化及發(fā)育有著重要影響的信號傳導(dǎo)途徑和一系列與細(xì)胞發(fā)育分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，均能與HATs或

5、HDACs互相作用。因此，HATs/HDACs的表達(dá)活性的異常，可能與急性髓系白血病及其他血液腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。本實驗通過檢測髓系腫瘤（急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合征、慢性骨髓增殖性腫瘤）患者骨髓單個核細(xì)胞（BM-MNCs）中ASXL1突變、ASXL1 mRNA表達(dá)水平及HATs/HDACs表達(dá)水平，分析ASXL1突變、ASXL1基因表達(dá)水平對髓系腫瘤的影響， HATs/HDACs表達(dá)失衡對髓系腫瘤的影響，以及ASXL1基因

6、表達(dá)水平高低與HATs/HDAC表達(dá)失衡有無相關(guān)性。
　　方法：本實驗收集了河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院初治急性髓系白血?。ˋML）患者的骨髓液40例（其中AML-M215例、AML-M413例、AML-M512例），治療后達(dá)完全緩解（CR）的AML患者16例，骨髓增生異常綜合征（MDS）患者15例（其中中低危組患者8例、高危組患者7例），慢性骨髓增殖性腫瘤（cMPN）患者15例（其中原發(fā)性骨髓纖維化（MF）3例、原發(fā)性血小板增多癥（ET

7、）7例、真性紅細(xì)胞增多癥（PV）5例），并收集17例血液系統(tǒng)非惡性疾病患者骨髓液設(shè)為對照組。通過RQ-PCR及酶聯(lián)免疫吸附測定法（ Elisa法）,檢測骨髓液單個核細(xì)胞（BM-MNCs）中ASXL1的mRNA表達(dá)水平和HDAC1、P300的表達(dá)水平，并將AML患者骨髓液外送海斯特公司檢測ASXL1基因突變。
　　結(jié)果：
　　1.ASXL1 mRNA的表達(dá)情況
　　RQ-PCR結(jié)果顯示：初治的40例AML患者中單個核細(xì)胞

8、中ASXL1 mRNA的相對表達(dá)量為（0.9548±0.1717）,16例治療后達(dá)CR的AML患者中單個核細(xì)胞中ASXL1 mRNA的相對表達(dá)量為（1.0113±0.1506），15例MDS患者單個核細(xì)胞中ASXL1 mRNA的相對表達(dá)量為（0.9542±0.1262），15例cMPN患者單個核細(xì)胞中ASXL1 mRNA的相對表達(dá)量為（0.9605±0.1167），17例對照組單個核細(xì)胞中ASXL1 mRNA的相對表達(dá)量為（0.9627

9、±0.1484），初治AML組與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.869），完全緩解AML組與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.378），MDS組與對照組比無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.863），cMPN組與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.963）。
　　2.ASXL1基因突變情況
　　外送海斯特公司的ASXL1突變檢測結(jié)果顯示：初治的40例AML患者中均未檢測到ASXL1基因的有意義突變。
　　3.HDAC1蛋白表達(dá)情況

10、　　Elisa法測HDAC1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：40例初治AML患者HDAC1蛋白表達(dá)量為（11.6138±2.0422）pg/ml，16例治療達(dá)CR的AML患者HDAC1蛋白表達(dá)量為（6.5188±1.6942）pg/ml，15例MDS患者HDAC1蛋白表達(dá)量為（12.6140±1.3007）pg/ml，15例cMPN患者中HDAC1蛋白表達(dá)量為（7.5193±1.2447）pg/ml，17例對照組患者中HDAC1蛋白表達(dá)量（3.958

11、8±1.4251）pg/ml，所測初治AML患者與對照組相比其HDAC1蛋白表達(dá)量升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；緩解組HDAC1蛋白表達(dá)量低于初治AML患者，高于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），測MDS患者與對照組相比其HDAC1蛋白表達(dá)量升高，且其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；所測cMPN患者與對照組相比其HDAC1蛋白表達(dá)量升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。40例初治AML患者中，男性患者

12、有23例，女性患者有17例，其HDAC1蛋白表達(dá)量分別為（11.5939±1.9680）pg/ml、（11.6406±2.1997）pg/ml，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.944）；40例初治AML患者中，60歲以上患者有7例，60歲以下患者有33例，其HDAC1蛋白表達(dá)量分別為（11.4671±1.5632）pg/ml、（11.6449±2.1492）pg/ml，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.837）；40例初治AML患者，AML-

13、M2患者有15例，AML-M4患者有13例，AML-M5患者有12例，其HDAC1蛋白表達(dá)量分別為（11.4133±2.0796）pg/ml、（11.1162±2.1725）pg/ml、（12.4033±1.7622）pg/ml，其相互之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.264）。15例MDS患者中，中低危組患者有8例，高危組患者有7例，其HDAC1蛋白表達(dá)量分別為（11.6550±0.7962）pg/ml、（13.7100±0.7615）pg

14、/ml，高危組MDS患者HDAC1蛋白表達(dá)水平高于中低危組，兩組之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000）,15例cMPN中有3例PMF、7例ET、5例PV，其HDAC1蛋白表達(dá)量分別為（7.3800±0.8945）pg/ml、（8.0529±1.2480）pg/ml、（6.8560±1.2730）pg/ml，其相互之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.270）。
　　4.P300蛋白表達(dá)情況
　　Elisa法測P300蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：40

15、例初治AML患者P300蛋白表達(dá)量為（0.8584±0.2103）pg/ml，16例治療達(dá)CR的AML患者P300蛋白表達(dá)量為（1.0509±0.1649）pg/ml，15例MDS患者P300蛋白表達(dá)量為（0.9557±0.1278）pg/ml，15例cMPN患者中P300蛋白表達(dá)量為（0.8495±0.1320）pg/ml，17例對照組患者中P300蛋白表達(dá)量為（1.2506±0.1634）pg/ml，所測AML患者與對照組相比其P3

16、00蛋白表達(dá)量降低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；緩解組P300蛋白表達(dá)量高于初治AML患者，低于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），所測MDS患者與對照組相比其P300蛋白表達(dá)量降低，且其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；所測cMPN患者與對照組相比其P300蛋白表達(dá)量降低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。40例初治AML患者中，男性患者有23例，女性患者有17例，其P300蛋白表達(dá)量分別為（0.8832±0

17、.2330）pg/ml、（0.8248±0.1762）pg/ml，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.393）；40例初治AML患者中，60歲以上患者有7例，60歲以下患者有33例，其P300蛋白表達(dá)量分別為（0.9887±0.2277）pg/ml、（0.8307±0.1991）pg/ml，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.070）；40例初治AML患者，AML-M2患者有15例，AML-M4患者有13例，AML-M5患者有12例，其P300蛋白

18、表達(dá)量分別為（0.9335±0.2198）pg/ml、（0.8486±0.1663）pg/ml、（0.7751±0.2230）pg/ml，其相互之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.148）。15例MDS患者中，中低危組患者有8例，高危組患者有7例，其P300蛋白表達(dá)量分別為（1.0501±0.0776）pg/ml、（0.8479±0.0751）pg/ml，高危組患者P300蛋白表達(dá)水平比中低危組低，兩組之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000），15例

19、cMPN中有3例PMF、7例ET、5例PV，其P300蛋白表達(dá)量分別為（0.8890±0.0960）pg/ml、（0.8324±0.1387）pg/ml、（0.8498±0.1606）pg/ml，其相互之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.846）。
　　5.HDAC1/P300比值情況
　　HDAC1/P300比值結(jié)果顯示：40例初治AML患者HDAC1/P300比值為（14.6279±5.2376），16例治療達(dá)CR的AML患者H

20、DAC1/P300比值為（6.4808±2.2812），15例MDS患者PHDAC1/P300比值為（13.0624±3.2777），15例cMPN患者中HDAC1/P300比值為（9.0993±2.4647），17例對照組患者中HDAC1/P300比值表達(dá)量為（3.1766±1.1952），所測AML患者與對照組相比其HDAC1/P300比值升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；緩解組HDAC1/P300比值低于初治AML患者，

21、高于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），所測MDS患者與對照組相比其 HDAC1/P300比值升高，且其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；所測cMPN患者與對照組相比其HDAC1/P300比值升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。40例初治AML患者中，男性患者有23例，女性患者有17例，其HDAC1/P300比值分別為（14.5026±5.9727）、（14.7971±4.2148），兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.8

22、63）；40例初治AML患者中，60歲以上患者有7例，60歲以下患者有33例，其HDAC1/P300比值分別為（12.4147±4.5907）、（15.0974±5.3088），兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.223）；40例初治AML患者，AML-M2患者有15例，AML-M4患者有13例，AML-M5患者有12例，其HDAC1/P300比值分別為（13.2262±5.1498）、（13.5783±3.4953）、（17.5171±6.

23、0905），其相互之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.069）。15例MDS患者中，中低危組患者有8例，高危組患者有7例，其HDAC1/P300比值分別為（11.1976±1.5447）、（16.3507±2.4001），高危組患者HDAC1/P300比值比中低危組高，兩組之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000），15例cMPN中有3例PMF、7例ET、5例PV，其HDAC1/P300比值分別為（8.3051±0.4959）、（9.9919±2.85

24、02）、（8.3264±2.5180）,其相互之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.455）。
　　結(jié)論：
　　1.本組檢測的髓系腫瘤中未發(fā)現(xiàn)ASXL1基因表達(dá)與對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.本組髓系腫瘤中未發(fā)現(xiàn)有病理意義的ASXL1突變。
　　3.在髓系腫瘤中，HDAC1表達(dá)水平明顯升高，P300表達(dá)水平明顯降低，證明HDACs/HATs表達(dá)失衡對髓系腫瘤的發(fā)生有著重要影響。
　　4.在AML患者中，治療后達(dá)CR