外泌體中miR-193a在FSGS發(fā)病機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：提取分離并鑒定出尿液外泌體，研究miR-193a在MCD和FSGS患兒尿液外泌體中的表達(dá)，并分析FSGS患兒尿液外泌體 miR-193a表達(dá)與腎臟組織病理學(xué)的聯(lián)系，初步探討miR-193a通過(guò)調(diào)節(jié)自噬而參與FSGS發(fā)病機(jī)制。
　　方法：1.通過(guò)試劑盒方法從尿液中提取出所需要的外泌體，通過(guò)透射電鏡和Western blotting鑒定所提出的即為外泌體；
　　2.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)miR-193a在F

2、SGS和MCD患兒尿液外泌體中的表達(dá)情況；
　　3.采用ROC曲線分析尿液外泌體中miR-193a是否可以用來(lái)區(qū)別FSGS和MCD，通過(guò)Raij方法對(duì)FSGS患兒腎臟病理腎小球硬化指數(shù)進(jìn)行評(píng)分，利用Spearman相關(guān)性分析FSGS患兒尿液外泌體表達(dá)量與其腎小球硬化指數(shù)相關(guān)性的分析；
　　4.采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)腎組織外泌體標(biāo)志蛋白CD63的表達(dá)、自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)以及miR-193a的下游靶基因MCL-

3、1的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.透射電鏡下可以觀察到從尿液提取出的外泌體呈現(xiàn)為橢圓形或圓形膜性囊泡結(jié)構(gòu)，膜性囊泡的平均直徑在40-120nm之間。Western Blot證實(shí)所提出的外泌體的膜表面上有特性性的標(biāo)志物CD9和HSP70的表達(dá)；
　　2.與MCD患兒相比，F(xiàn)SGS患兒尿液外泌體中miR-193a的表達(dá)量是其3.56倍（P＜0.05)；
　　3.ROC曲線分析可得知，miR-193a對(duì)FSGS和MCD患兒具有著

4、一定的鑒別能力(ROC曲線下面積＝0.85，P＜0.04),而FSGS患兒腎小球硬化指數(shù)評(píng)分與其尿液中外泌體中miR-193a的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系(r=0.602，P＜0.024)。
　　4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，F(xiàn)SGS患者相對(duì)于MCD患兒的腎組織染色標(biāo)本中，無(wú)論是正常節(jié)段還是硬化節(jié)段足細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)大量的外泌體標(biāo)志蛋白CD63的表達(dá)，而與此同時(shí)可見(jiàn)miR-193a的下游靶基因MCL-1的表達(dá)水平是明顯減弱的。而Beclin

5、-1的代表自噬水平標(biāo)志物的明顯低于MCD患兒。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功的從人體尿液中分離并鑒定出外泌體，并順利提出 RNA分子；另外研究發(fā)現(xiàn)miR-193a在FSGS患兒尿液外泌體中的表達(dá)量明顯增高，通過(guò)ROC曲線分析可知，其具有一定的區(qū)別診斷FSGS的能力；通過(guò)線性相關(guān)分析可以得知尿外泌體miR-193a與FSGS患者的腎小球硬化指數(shù)呈現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系。免疫組織化學(xué)研究顯示外泌體中miR-193a的高表達(dá)可能抑制足細(xì)胞的自噬水平，從