乙醇-烏頭堿聯(lián)合染毒對(duì)心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)及RyR2-ser2808磷酸化影響的研究.pdf

1、在我國(guó)烏頭、附子及雪上一支蒿等76種烏頭屬植物被中醫(yī)學(xué)一直沿用至今。烏頭堿是烏頭屬植物中的主要有效成分，在強(qiáng)心、治療風(fēng)濕、緩解疼痛、抗腫瘤及免疫抑制等方面具有醫(yī)用價(jià)值。但是烏頭堿也具有心臟毒性及神經(jīng)毒性，它可以引起中樞神經(jīng)和呼吸中樞抑制，同時(shí)引起多種心律失常，如室性心動(dòng)過速、房室傳導(dǎo)阻滯及室性纖顫等。而惡性心律失常是烏頭堿中毒者最終死亡的主要原因。在民間用烏頭屬植物浸泡藥酒進(jìn)行止痛、強(qiáng)身的習(xí)慣，但是每年都有因飲用烏頭藥酒中毒甚至死亡的案

2、件發(fā)生。雖然少數(shù)研究從毒物代謝學(xué)角度提出乙醇能增加烏頭堿等有毒成分的溶解度，促進(jìn)其吸收，但未有研究探索兩者對(duì)心臟產(chǎn)生的毒性效應(yīng)的相互關(guān)系及具體作用機(jī)制。研究顯示電壓門控鈣離子通道包括雷諾定受體(Ryanodine receptor2，RyR2)易被烏頭堿及乙醇影響而發(fā)生改變。鈣穩(wěn)態(tài)破壞及RyR2-ser2808被過度磷酸化會(huì)引起心律失常及心力衰竭。目前尚未有關(guān)于乙醇-烏頭堿聯(lián)合染毒對(duì)心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)及RyR2-ser2808蛋白磷酸化影響

3、的相關(guān)研究報(bào)道。
　　目的：
　　研究乙醇-烏頭堿聯(lián)合染毒對(duì)心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)及RyR2-ser2808磷酸化影響相關(guān)性問題。為進(jìn)一步探索乙醇和烏頭堿毒性效應(yīng)的相互關(guān)系及具體作用機(jī)制指明道路，為臨床醫(yī)學(xué)及藥學(xué)制作有效解毒劑提供理論基礎(chǔ)，為法醫(yī)學(xué)獲取更便捷的檢測(cè)手段提供可能性。
　　方法：
　　選取來自動(dòng)物中心的1-3天SPF級(jí)大鼠的乳鼠，按照無菌操作要求剪取心臟，心室肌組織采用由胰酶、膠原酶、及牛血清蛋白組成的消化液

4、進(jìn)行消化，懸浮細(xì)胞采用差速貼壁法及5-溴脫氧尿嘧啶（5-Bromo-2-Deoxyuridine，5-Brdu）抑制成纖維細(xì)胞法進(jìn)行純化，采用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-6天完成原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)。心室肌細(xì)胞分成5組并進(jìn)行染毒。對(duì)照組為無血清培養(yǎng)基組（A組），烏頭組為1.0μmol/L烏頭堿染毒組（B組），烏頭堿+乙醇組為1.0μmol/L烏頭堿及乙醇聯(lián)合染毒組（C組），其中C組分C1、C2及C3共三組，即1.0μmol/L烏頭堿+5mmol/L

5、乙醇染毒組（C1組），1.0μmol/L烏頭堿+50mmol/L乙醇染毒組（C2組），1.0μmol/L烏頭堿+100mmol/L乙醇染毒組（C3組）。急性染毒心室肌細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間為1小時(shí)。后各組分別進(jìn)行Western Blot檢測(cè)和激光共聚焦顯微鏡的觀察。Western Blot檢測(cè)RyR2-ser2808磷酸化蛋白及PKA蛋白的表達(dá)情況。5組心室肌細(xì)胞進(jìn)行Fluo-4探針標(biāo)記后通過激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)從而觀察鈣穩(wěn)態(tài)的情況。
　

6、　結(jié)果：
　　采用本方法可以得到較高純度并滿足相關(guān)實(shí)驗(yàn)要求的心室肌細(xì)胞。使用 CCK-8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，通過與對(duì)照組對(duì)比，顯示1μM的烏頭堿可以降低其活性。除加入1μM烏頭堿外，同時(shí)加入乙醇的干預(yù)后，顯示其活性與乙醇的濃度有關(guān)。通過激光共聚焦檢測(cè)，除對(duì)照組外其余組的未出現(xiàn)典型鈣火花現(xiàn)象，鈣振蕩振幅減小，鈣穩(wěn)態(tài)破壞。1μM的烏頭堿染毒組（B組）與對(duì)照組相比，其心室肌細(xì)胞的PKA蛋白表達(dá)量升高。與1μM的烏頭堿染毒組對(duì)比，中及

7、高濃度的乙醇及烏頭堿聯(lián)合染毒可以使PKA蛋白表達(dá)量升高，但低濃度的乙醇無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1μM的烏頭堿可以使RyR2-Ser2808磷酸化蛋白表達(dá)量升高。與1μM的烏頭堿染毒組對(duì)比，中及高濃度的乙醇與1μM烏頭堿聯(lián)合染毒RyR2-Ser2808蛋白磷酸化表達(dá)量顯著升高。
　　結(jié)論：
　　1μM烏頭堿可以通過影響鈣振蕩破壞鈣平衡。溶于中、高濃度的乙醇的烏頭堿可以進(jìn)一步破壞鈣振蕩及鈣穩(wěn)態(tài)。同時(shí)烏頭堿及溶于中、高濃度的乙醇的烏頭堿影響

8、RyR2-Ser2808蛋白磷酸化水平（升高）及PKA的蛋白表達(dá)上調(diào)。PKA蛋白結(jié)果與RyR2-Ser2808蛋白磷酸化水平結(jié)果相互印證，支持PKA介導(dǎo)RyR2-Ser2808蛋白磷酸化的觀點(diǎn)。烏頭堿及中、高濃度的乙醇都具有心臟毒性，能降低心肌細(xì)胞活力。溶于中、高濃度乙醇的烏頭堿其可通過影響RyR2-Ser2808蛋白磷酸化水平途徑，破壞鈣穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生各種惡性心律失常。該途徑可能是烏頭堿與乙醇聯(lián)合作用于心臟的毒理學(xué)機(jī)制之一，其引起心率失常