下調(diào)RbAp48表達抑制人消化道腫瘤細胞的增殖.pdf

1、研究背景:
　　消化道腫瘤是最常見的惡性腫瘤之一。食管癌、大腸癌、胃癌等的發(fā)病率和死亡率一直位居各種癌癥的前列。當(dāng)前對消化道腫瘤的治療主要采用手術(shù)、放療以及化療，但是放、化療的毒副作用明顯，且效果并不令人滿意。因此，尋找新的藥物治療靶點顯得尤為重要。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)RbAp48基因表達能抑制肺癌細胞生長并逆轉(zhuǎn)其順鉑耐藥性。由此本研究設(shè)想:下調(diào)RbAp48表達也可能對消化道腫瘤的生長繁殖存在抑制作用;RbAp48

2、可能是治療消化道腫瘤的一個潛在靶點，為此我們進行了相關(guān)的研究。.
　　第一部分下調(diào)RbAp48表達對人食管癌細胞增殖作用的研究
　　目的:研究下調(diào)RbAp48表達對人食管癌細胞增殖的作用，探索RbAp48作為食管癌治療靶點的可能性。方法:1、免疫組化檢測RbAp48在食管癌組織及其癌旁組織中的表達。2、Western blot法檢測siRNA干擾RbAp48表達效果。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后:①MTT法檢測人食

3、管癌細胞EC109、人正常上皮細胞L132生長情況。②平板克隆形成實驗檢測EC109細胞克隆形成能力變化。③MTT檢測EC109、EC109/DDP細胞對順鉑敏感性變化。4、體內(nèi)實驗:BABL/C裸鼠皮下接種EC109成瘤后，瘤內(nèi)注射RbAp48-siRNA，比較腫瘤生長差異。5、①β-半乳糖酐酶染色法檢測細胞衰老情況。②流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化及細胞凋亡。結(jié)果:1、RbAp48在食管癌組織中表達明顯高于其癌旁組織中的表達。2、RbA

4、p48-siRNA能有效下調(diào)EC109細胞株中RbAp48的表達。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后:①陰性對照組與RbAp48-siRNA組EC109細胞的抑制率分別為:(18.54±2.80)％、(45.24±2.74)％(p＜0.01)，RbAp48-siRNA組抑制率明顯升高，而正常上皮細胞株L132細胞生長抑制率無顯著變化(p＞0.05）;②空白組、陰性對照組、RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)分別為165.00±13.

5、00、161.00±11.53和101.00±3.61，RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)明顯減少(p＜0.01)。③順鉑對EC109空白組、陰性對照組和RbAp48-siRNA組細胞的IC50值分別為4.76±0.09μmol/L、2.87±0.14μmol/L、0.89±0.02μmol/L(p＜0.01)，順鉑對食管癌耐藥株細胞EC109/DDP空白組、陰性對照組和RbAp48-siRNA組細胞的IC50值分別為25.69±0.

6、69μmol/L、15.58±0.36μmol/L、8.26±0.96μmol/L(p＜0.01)，兩種細胞對順鉑敏感性均顯著增加。4、體內(nèi)實驗:與空白組相比，腫瘤重量由997.10±141.50mg下降為202.50±81.34 mg(p＜0.01)，腫瘤體積由1627.00±261.90mm3下降為371.40±155.90 mm3(p＜0.01)。5、①與空白組、陰性對照組相比，RbAp48-siRNA組細胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。②

7、與空白組、陰性對照組相比，RbAp48-siRNA組細胞發(fā)生明顯G2/M期阻滯:轉(zhuǎn)染后第三天G2/M期細胞比例分別由(13.35±2.84)％、(16.97±2.64)％上升為(31.48±11.39)％(p＜0.01)。③與空白組、陰性對照組相比，RbAp48-siRNA組轉(zhuǎn)染后第四天細胞凋亡率由(5.44±1.36)％、(7.25±0.44)％上升為(12.18±0.50)％(p＜0.01)。結(jié)論:1、RbAp48在食管癌組織中表達

8、明顯高于其癌旁組織。2、下調(diào)RbAp48表達能阻滯食管癌細胞周期，誘導(dǎo)細胞衰老、凋亡，抑制細胞增殖，對正常細胞沒有明顯作用。3、下調(diào)RbAp48表達，能顯著提高食管癌細胞及其耐藥細胞株對順鉑的敏感性。4、RbAp48有望成為治療食管癌的新靶點。
　　第二部分下調(diào)RbAp48表達對人大腸癌細胞增殖作用的研究
　　目的:研究下調(diào)RbAp48表達對人大腸癌細胞增殖的作用，探索RbAp48作為大腸癌治療靶點的可能性。方法:1、免疫組

9、化檢測RbAp48在大腸癌組織及其癌旁組織中的表達。2、Western blot法檢測siRNA干擾RbAp48表達效果。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后:①MTT法檢測人大腸癌細胞HT-29、人正常上皮細胞L132生長情況。②平板克隆形成實驗檢測HT-29細胞克隆形成能力變化。③MTT法檢測HT-29細胞對5-FU敏感性變化。4、體內(nèi)實驗:BABL/C裸鼠皮下接種HT-29成瘤后，瘤內(nèi)注射RbAp48-siRNA，比較腫瘤生長差

10、異。5、①β-半乳糖酐酶染色法檢測細胞衰老情況。②流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化及細胞凋亡。結(jié)果:1、RbAp48在大腸癌組織中表達明顯高于其癌旁組織。2、RbAp48-siRNA能有效下調(diào)HT-29中RbAp48的表達。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后:①陰性對照組與RbAp48-siRNA組抑制率分別為:(5.08±1.24)％、(33.69±6.30)％(p＜0.01)，RbAp48-siRNA組抑制率明顯升高，而正常上皮細胞

11、株L132細胞生長抑制率無顯著變化(p＞0.05)。②空白組、陰性對照組、RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)分別為組108.70±4.67、103.00±2.08和68.00±4.62，RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)明顯減少(p＜0.01)。③5-FU對HT-29空白組、陰性對照組和RbAp48-siRNA組細胞的IC50值分別為94.89±6.97μmol/L、57.42±2.74μmol/L和17.80±0.42μmol/L

12、(p＜0.01)，細胞對5-FU敏感性均顯著增加。4、體內(nèi)實驗:與空白組相比，腫瘤重量由210.2±93.04 mg下降為90.44±59.87 mg(p＜0.05)，腫瘤體積由377.20±193.40mm3下降為141.80±79.35mm3(p＜0.05)。5、①與空白組、陰性對照組相比，RbAp48-siRNA組細胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。②RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染HT-29細胞后未發(fā)生明顯細胞周期阻滯也未發(fā)生明顯細胞凋亡。結(jié)論

13、:1、RbAp48在大腸癌組織中表達明顯高于其癌旁組織。2、下調(diào)RbAp48表達能誘導(dǎo)細胞衰老，抑制細胞增殖，對正常細胞沒有明顯作用。3、下調(diào)RbAp48表達能顯著提高大腸癌細胞對5-FU的敏感性。4、RbAp48有望成為治療大腸癌的新靶點。
　　第三部分下調(diào)RbAp48表達對人胃癌細胞增殖作用的研究
　　目的:研究下調(diào)RbAp48表達對人胃癌細胞增殖的作用，探索RbAp48作為胃癌治療靶點的可能性。方法:1、免疫組化檢測R

14、bAp48在胃癌組織及其癌旁組織中的表達。2、Western blot法檢測siRNA干擾RbAp48表達效果。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后:①MTT法檢測人胃癌細胞HGC-27、人正常上皮細胞L132細胞生長情況。②平板克隆形成實驗檢測克隆形成能力。③MTT檢測HGC-27細胞對5-FU敏感性變化。4、①β-半乳糖酐酶染色法檢測細胞衰老情況。②流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化及細胞凋亡。結(jié)果:1、RbAp48在胃癌組織中表達明顯

15、高于在胃癌旁組織中的表達。2、RbAp48-siRNA能有效下調(diào)HGC-27中RbAp48的表達。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后:①陰性對照組與RbAp48-siRNA組抑制率分別為:(35.00±2.04)％、(70.39±1.21)％(p＜0.01)，RbAp48-siRNA組抑制率明顯升高，而正常上皮細胞株L132細胞生長抑制率無顯著變化(p＞0.05)。②空白組、陰性對照組、RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)分別為組1

16、11.30±8.62、31.33±2.19和4.00±1.73，RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)明顯減少(p＜0.01)。③5-FU對HGC-27空白組、陰性對照組和RbAp48-siRNA組細胞的IC50值分別為3.42±0.39μmol/L、1.84±0.04μmol/L和0.07±0.02μmol/L(p＜0.01)，下調(diào)RbAp48表達后細胞對5-FU敏感性均顯著增加。4、①與空白組、陰性對照組相比，RbAp48-siRNA

17、組細胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。②與空白組、陰性對照組相比，RbAp48-siRNA組細胞發(fā)生明顯G2/M期阻滯:轉(zhuǎn)染后第五天G2/M期細胞比例分別由(8.42±0.28)％、(13.33±2.94)％上升為(30.75±1.65)％(p＜0.01)。③與空白組、陰性對照組相比，RbAp48-siRNA組轉(zhuǎn)染第五天細胞凋亡率由(14.94±5.90)％、(16.02±2.12)％上升為(61.30±8.07)％(p＜0.01)。結(jié)論:1、Rb