鼠李糖乳酸桿菌培養(yǎng)上清液對慢加急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用.pdf

1、背景和目的:
　　隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社交活動(dòng)日益增多，人均酒精消耗在世界范圍內(nèi)不斷增加，酒精性肝損傷患者數(shù)量呈上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有80％酗酒者表現(xiàn)出一定程度的酒精性肝損傷特征，10～35％可進(jìn)展為酒精性肝炎，10～20％可進(jìn)展為酒精性肝硬化。輕度的酒精性肝損傷在戒酒后可能被逆轉(zhuǎn)，但是嚴(yán)重的酒精性肝損傷可能導(dǎo)致酒精性肝硬化或誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死，最終造成肝功能衰竭，導(dǎo)致不可逆的生命危險(xiǎn)。腸道屏障的損傷引起菌群移位、內(nèi)毒素經(jīng)過腸道屏障吸收，

2、激活免疫應(yīng)答，對酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展起到重大影響。然而，目前針對酒精性肝損傷尚無特效治療藥物，尋求新的臨床治療藥物是亟待解決的問題。利用益生菌保護(hù)腸道屏障作用的研究中，目前對于鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)的研究較為深入，該菌種可降低腸道屏障通透性，減輕酒精性肝損傷，但是其確切的保護(hù)機(jī)制尚未闡明。本試驗(yàn)通過在飲食中加入LGG培養(yǎng)上清液(LGG-s)，干預(yù)慢加急性酒精性肝損傷小鼠模型，檢測

3、小鼠外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)量的影響，以及IL-17蛋白表達(dá)水平的改變，并探討LGG-s發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.LGG-s的制備:購買鼠李糖乳酸桿菌菌種，按照ATCC培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，接種于MRS培養(yǎng)基，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)菌種，按3％接種量接種。將鼠李糖乳酸桿菌培養(yǎng)至109U/ml菌落形成后，4℃、5000g/min的條件下離心10分鐘，上清液通過0.22-μm過濾器過濾菌體，收集上清液作為LG

4、G-s，儲存于4℃冰箱備用。
　　2.慢加急性酒精性肝損傷小鼠模型的建立:在本試驗(yàn)中，我們采用10周齡的C57BL/6雄性小鼠，建立慢加急性酒精喂養(yǎng)小鼠模型，研究LGG-s在預(yù)防酒精性肝病中的作用及其機(jī)制。建模過程中，模型組小鼠以含5％酒精的Lieber-DeCali流質(zhì)飲食飼養(yǎng)10日，在第11日上午給予1次大劑量(5g/kg體重)酒精灌胃。灌胃后第9小時(shí)，麻醉并處死小鼠。建模的全過程中，除流質(zhì)飲食中的水分之外，保證小鼠不能接觸到

5、其它水源。
　　3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):18只10周齡C57BL/6雄性小鼠，按每組6只隨機(jī)將小鼠分為3組，分別為模型組、對照組和治療組。對照組建模過程以等熱量的麥芽糖糊精代替模型組飲食中和灌胃所用的酒精，其余處理與模型組保持一致。治療組小鼠飲食在模型組飲食的基礎(chǔ)上加入LGG-s，保證每日小鼠進(jìn)食中包含LGG-s超過1ml。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于灌胃后第9小時(shí)處死并采集血、小腸和肝臟標(biāo)本。肝組織-80℃保存用于油紅O染色。經(jīng)修邊、固定、石蠟包埋的肝

6、組織用于制備石蠟切片HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的炎癥變化和脂滴形成。收集回腸末端1.5cm腸組織，延長軸剖開，行HE染色，步驟同肝組織。全自動(dòng)生化儀檢測各組小鼠生化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)的變化。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測腸組織中Occludin、Claudin-1、ZO-1的mR

7、NA表達(dá)情況。Western-Blot檢測各組小鼠肝組織大腸埃希菌菌體蛋白的含量。全血樣本流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17和Treg細(xì)胞在CD4+T淋巴細(xì)胞中的比例。ELISA檢測血清中IL-17蛋白的表達(dá)水平。
　　4.計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.建立小鼠NIAAA(National Institute

8、 on Alcohol Abuse and Alcoholism，NIAAA)模型:11日建模過程后，小鼠肝功能異常在灌胃后第9小時(shí)達(dá)到的峰值，外周血血清檢測示ALT水平為150.30±40.84 U/L，AST水平為393.3±176.1 U/L，較對照組顯著升高，且肝組織病理HE染色和油紅O染色觀察到顯著的大脂滴形成和肝組織壞死。慢加急性酒精性肝損傷小鼠模型建模成功。
　　2.LGG-s對NIAAA模型治療效果觀察:模型組小鼠

9、平均血清ALT水平和AST水平較對照組（ALT:54.83±11.36U/L，AST:240.0±72.79U/L，P＜0.05）明顯升高，而LGG-s治療組血清ALT、AST(ALT:64.50±11.36U/L，AST:192.8±25.44U/L)較模型組均有明顯下降(P＜0.01)，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FALT=25.828，PALT＜0.01;FAST=5.354，PAST＜0.05)。對照組與治療組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義。組織學(xué)觀察，AF組中可見大泡性脂肪變性，脂肪變性分布廣泛，而經(jīng)LGG-s治療后脂肪變性明顯減少，無壞死灶，但與正常對照組相比，仍有小泡性脂肪變性形成。檢測各組小腸組織中Claudin-1、Occludin、zonulaoccludens-1(ZO-1)的mRNA表達(dá)含量。模型組Claudin-1和ZO-1的轉(zhuǎn)錄水平較對照組顯著下降(P＜0.001)，LGG-s治療后有所恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但是治療組較對照組轉(zhuǎn)錄水

11、平仍降低(P＜0.01)。但是治療組中Occludin的轉(zhuǎn)錄水平雖較模型組有所升高，然而并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blotting檢測肝組織中大腸埃希菌菌體蛋白表達(dá)量，對照組、模型組和治療組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=47.429，P＜0.01)，兩兩比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。其變化趨勢與腸道緊密連接蛋白的變化相反。分離小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞，模型組中Th17細(xì)胞比例較對照組升高，

12、治療組中下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.841，P＜0.01);而Treg細(xì)胞比例在模型組中下降，治療后顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.192，P＜0.01)。ELISA檢測外周血中IL-17的蛋白表達(dá)在模型組（160.7±43.93pg/ml）較對照組（116.7±15.54pg/ml）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，LGG-s治療后（115.1±9.877pg/ml）顯著下降。
　　結(jié)論:
　　1.L