課題一：維生素D受體及其基因多態(tài)性在再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制中的作用課題二：IL-35在獲得性再生障礙性貧血中的表達(dá)及其作用研究.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)課題進(jìn)行探討：
　　課題一 維生素D受體及其基因多態(tài)性在再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制中的作用
　　第一部分 維生素D受體在獲得性再生障礙性貧血免疫失耐受中的作用研究
　　目的:本研究旨在檢測(cè)1，25(OH)2D3和VDR在AA患者中的表達(dá)，同時(shí)評(píng)價(jià)1，25(OH)2D3對(duì)AA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的作用，探討其在AA發(fā)病機(jī)制中的

2、作用，為AA的免疫抑制治療提供新的思路。
　　方法:(1)通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血漿中25(OH)D3的表達(dá)，并進(jìn)一步分析25(OH)D3水平與AA患者各臨床參數(shù)之間的關(guān)系;(2)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)PBMCs以及1，25(OH)2D3處理后的PBMCs中VDR mRNA的表達(dá)水平;(3)通過(guò)CCK-8的方法檢測(cè)1，25(OH)2D3對(duì)PBMCs增殖的影響;(4)將患者PBMCs用1，25(OH)2D3處理，未處理組作為對(duì)

3、照。48小時(shí)后，采用ELISA的方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-10和TGF-β1的水平變化，實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)T細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3mRNA的表達(dá)變化，同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)1，25(OH)2D3處理的PBMCs內(nèi)Th1（CD3+CD8-IFNγ+）、Th2(CD3+CD8-IL4+)、Tc1(CD3+CD8+IFNγ+)、Tc2(CD3+CD8+IL

4、4+)和Th17(CD3+CD8-IL17+)細(xì)胞的比例變化。
　　結(jié)果:(1)初治AA患者血漿25(OH)D3的水平與完全緩解患者、正常對(duì)照組無(wú)顯著差異;(2)AA患者血漿25(OH)D3的水平與血小板計(jì)數(shù)、自然殺傷T細(xì)胞(naturalkiller T cells，NKT)比例呈顯著正相關(guān)，與B細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān);(3)初治AA患者PBMCs VDR mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組;(4)體外刺激實(shí)驗(yàn)顯示1,25(OH)2D

5、3抑制AA患者PBMCs的增殖;(5)外源性1,25(OH)2D3的加入明顯抑制AA患者PBMCs分泌TNF-α、IFN-γ和IL-17A，并促進(jìn)TGF-β1的產(chǎn)生;(6)1，25(OH)2D3抑制Th1、Tc1和Th17細(xì)胞的極化，同時(shí)促進(jìn)Th2和Tc2細(xì)胞的極化，實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)1，25(OH)2D3抑制AA患者PBMCs內(nèi)T-bet、RORγtmRNA的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)GATA3、Foxp3 mRNA的表達(dá);(7)1，

6、25(OH)2D3處理后正常對(duì)照組PBMCs中VDR mRNA的表達(dá)水平明顯上調(diào)，AA患者卻無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:初治AA患者PBMCs中VDR表達(dá)水平明顯降低，低表達(dá)的VDR可能使維生素D-VDR通路信號(hào)傳導(dǎo)減弱，從而導(dǎo)致AA的“高免疫”狀態(tài)。適量的補(bǔ)充維生素D可通過(guò)增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)部分糾正AA免疫失耐受，有望成為一種新的輔助性治療策略。
　　第二部分 維生素D受體基因多態(tài)性與獲得性再生障礙性貧血的相關(guān)性研究
　　目

7、的:本研究旨在探討VDR基因四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(rs2228570、rs1544410、rs7975232和rs731236)與AA易感性的關(guān)系，并評(píng)價(jià)VDR基因多態(tài)性與AA嚴(yán)重程度、治療療效及晚期克隆演變等臨床特征的相關(guān)性。
　　方法:采集AA患者和正常對(duì)照的外周血并提取DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測(cè)反應(yīng)(PCR-LDR)的方法檢測(cè)197例AA患者和135例健康對(duì)照rs1544410(c.1024+283 G＞A)、rs797

8、5232(c.1025-49G＞T)和rs731236(c.1056T＞C)的基因型。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測(cè)rs2228570(c.2T＞C)的基因型。應(yīng)用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)與AA易感性、疾病嚴(yán)重程度、治療療效、克隆演變及其他臨床特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果:(1) VDR基因四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。(2)VDR基因rs15

9、44410、rs7975232和rs731236三個(gè)位點(diǎn)之間存在顯著的遺傳連鎖不平衡。(3)在VDR基因的四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，AA患者rs1544410位點(diǎn)GG基因型和G等位基因頻率顯著高于正常對(duì)照組，而其他三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與AA易感性無(wú)關(guān)。(4)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)rs1544410和rs7975232位點(diǎn)與非重型AA的發(fā)病相關(guān)，而rs2228570位點(diǎn)與重型AA的發(fā)病相關(guān)。(5) AA患者rs2228570位點(diǎn)的基因型與治療療效相關(guān):CC及C

10、T基因型患者預(yù)后好于TT基因型者。(6)AA患者rs2228570位點(diǎn)的基因型與晚期克隆演變亦密切相關(guān):TT基因型攜帶者更易于轉(zhuǎn)化為骨髓增生異常綜合征/急性髓系白血病，而CT基因型患者更易進(jìn)展為陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥。
　　結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明，在中國(guó)人群中，VDR基因多態(tài)性與AA的易感性、疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)。
　　課題二 IL-35在獲得性再生障礙性貧血中的表達(dá)及其作用研究
　　目的:本研究旨在檢測(cè)AA

11、患者血漿中IL-35的表達(dá)情況，并評(píng)估IL-35對(duì)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用，探討其在AA發(fā)病機(jī)制中的作用，為基于IL-35的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)收集患者臨床資料;(2)通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血漿中IL-35的表達(dá)，并進(jìn)一步分析IL-35水平與AA患者各臨床參數(shù)之間的關(guān)系;(3)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中IL-35兩個(gè)亞基p35和EBI3 mRNA的表達(dá)水平;(4)通過(guò)Brdu摻入法

12、檢測(cè)IL-35對(duì)PBMCs增殖的影響;(5)將患者和正常對(duì)照PBMCs用IL-35處理，未處理組作為對(duì)照。48小時(shí)后，采用ELISA的方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、 IL-17A、IL-10和TGF-β1的水平變化，流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞計(jì)數(shù)相結(jié)合的方法檢測(cè)CD4+/CD8+T細(xì)胞、Th1(CD3+CD8-IFNγ+)、Th2(CD3+CD8-IL4+)、Tc1(CD3+CD8+IFNγ+)、Tc2(CD3+CD8+IL4+)和T

13、h17(CD3+CD8-IL17+)細(xì)胞的比例和絕對(duì)數(shù)變化，同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)T細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3 mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)通過(guò)ELISA檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)初治AA患者血漿中IL-35的水平明顯低于完全緩解(CR)患者和正常對(duì)照組，而CR患者和正常對(duì)照組之間無(wú)顯著差異，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)IL-35水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。(2)在初治AA患者，血漿IL-35的水平

14、與血小板計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值和網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值呈顯著正相關(guān)，與淋巴細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)。(3)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示，初治重型AA患者p35和EBI3 mRNA表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，而初治非重型AA與正常對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。(4)體外刺激實(shí)驗(yàn)顯示IL-35能抑制AA患者PBMCs的增殖，進(jìn)而行細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)IL-35能抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖。(5)外源性IL-35的加入明顯抑制AA患者PBMCs分泌TNF-α、

15、IFN-γ和IL-17A，同時(shí)促進(jìn)TGF-β的產(chǎn)生。(6)IL-35抑制Th1、Tc1和Th17細(xì)胞的極化，同時(shí)促進(jìn)Th2和Tc2細(xì)胞的極化，實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果證實(shí)IL-35抑制AA患者PBMCs內(nèi)T-bet和RORγtmRNA的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)GATA3mRNA的表達(dá)，對(duì)Foxp3 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:初治AA患者體內(nèi)IL-35的表達(dá)水平降低，且與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，IL-35低表達(dá)可能致使Tregs失能，進(jìn)