應用多組學策略篩選肝癌候選標志物及NEK2和HSP90α的驗證.pdf

1、背景：
　　生物標志物（biomarkers）的研究是預防醫(yī)學核心研究內容之一，它是一種具有能夠客觀測量并評價一般生物過程、病理過程或對醫(yī)療干預相關藥物反應的指示物，也是生物體受到損害后的重要預警指標，涉及到細胞分子結構和功能的改變，生理活動的異常變化，生化代謝過程的改變，個體、群體或整個生態(tài)系統(tǒng)的異常表現等。生物標志物的研究為有效地預防和控制健康危害提供了理論依據。近年來隨著分子生物學及相關前沿生命學科的深入發(fā)展，生物標志物的研

2、究已成為國內外預防醫(yī)學界共同關注的熱點，被稱為是環(huán)境醫(yī)學發(fā)展到分子水平的一個重要里程碑，其研究在分子流行病學、環(huán)境衛(wèi)生學、勞動衛(wèi)生學、分子毒理學等諸多領域的價值是十分重要的。在環(huán)境流行病學的研究中，腫瘤分子標志物的研究對于預測腫瘤風險、評估臨床治療效果、判斷預后及指導三級預防等方面起了重要作用，因此被得到廣泛應用。
　　原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。據最新統(tǒng)計顯示，近年來肝癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，在世界范圍內其發(fā)病率

3、和死亡率分別位居男性惡性腫瘤的第5位和第2位、女性惡性腫瘤的第7位和第6位。其中，我國肝癌的新發(fā)病例和死亡病例數約占全球的一半左右，其死亡率僅次于胃癌。根據我國2010年腫瘤登記數據統(tǒng)計顯示，廣西肝癌的發(fā)病率和死亡率分別為43.76/10萬和35.82/10萬，均分別高于全國的肝癌發(fā)病率（28.71/10萬）和死亡率（26.04/10萬），位于全部惡性腫瘤死亡的第一位。隨著人口老齡化的加劇，肝癌的發(fā)病/死亡絕對數將會進一步上升，有研究表

4、明，預計到2030年肝癌的發(fā)病/死亡人數將增加60％。原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）具有惡性程度高，治療困難，發(fā)展速度快，生存時間短的特點，5年生存率不足10%。原發(fā)性肝細胞癌的臨床病象極不典型，其癥狀一般多不明顯，特別是在病程前期。目前，由于缺乏有效的早期診斷標志物，使得其只有30%~40%的肝癌患者可以獲得及時診斷和有效治療。因此迫切需要尋找一種特異度和敏感度均較高的肝癌標志物，以提高肝癌

5、的早期診斷水平，保證患者的預后。
　　腫瘤的發(fā)生與發(fā)展涉及到基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組等多個不同層次的病理過程。單組學數據分析是傳統(tǒng)腫瘤標志物的研究策略，往往只能體現出疾病樣本其中一個層面的變化，在篩選腫瘤標志物方面具有局限性。通過對多層次多組學數據的交集分析，將有助于人們更加系統(tǒng)全面的認識腫瘤的生物學行為，進一步為尋找有價值的腫瘤標志物和探討腫瘤相關機制提供新的線索。利用多種組學技術目前已成為腫瘤研究領域新興的熱點方向。

6、r>　　本研究將多種組學研究策略運用于肝癌標志物的篩選和鑒定：（1）采用細胞轉錄組學結合組織轉錄組學分析策略，尋找肝癌細胞和組織中共有的差異表達基因；（2）采用血清蛋白組學結合細胞轉錄組學分析策略，篩選肝癌血清和細胞中共有的差異表達因子。然后通過生物信息學分析其生物學特性及功能，進一步利用qRT-PCR、免疫組化、Western blotting等技術驗證差異因子在肝癌細胞、組織及血清中的表達水平，并結合臨床病理資料分析及生存率分析，為

7、肝癌的防治研究提供有價值的腫瘤分子標志物。
　　第一部分轉錄組學測序篩選肝癌潛在標志物NEK2
　　目的：
　　利用轉錄組學測序技術篩選肝癌細胞與肝癌組織中共有的差異表達基因，并驗證其在肝癌細胞和組織的表達水平，結合臨床病理資料分析和通路相關因子的關聯(lián)分析，探討其作為標志物在肝癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機制。
　　方法：
　　1.采用Ion Proton轉錄組測序平臺對肝癌細胞SMMC-7721和正常肝細胞L-

8、02進行轉錄組雙端測序，獲得差異表達基因。
　　2.將細胞轉錄組學與組織轉錄組學數據進行交集分析，得到共有的差異表達基因，并將差異表達最為明顯的基因列為候選標志物。
　　3.利用qRT-PCR驗證候選標志物NEK2基因在肝癌細胞SMMC-7721和正常肝細胞L-02，以及5例肝癌和癌旁組織中的表達水平；免疫組化驗證候選標志物NEK2蛋白在63例肝癌組織和癌旁組織中的表達水平。
　　4.分析候選標志物NEK2的表達與63

9、例肝癌樣本臨床病理特征之間的關系。
　　5.對候選標志物可能涉及通路中的關鍵蛋白p-AKT和MMP-2進行關聯(lián)性分析。
　　結果：
　　1.轉錄組測序結果顯示，在肝癌細胞SMMC-7721與正常肝細胞L-02中共得到差異表達基因611個，其中肝癌細胞中上調368個，下調243個。
　　2.將細胞轉錄組學和組織轉錄組學的差異表達基因進行交集分析，可以得到12個共有的差異表達基因，在肝癌中表達上調基因10個，表達下調

10、基因2個，其中NEK2在細胞轉錄組學和組織轉錄組學中差異最為明顯，因此將NEK2基因作為驗證的候選標志物。
　　3.驗證結果表明，NEK2 mRNA在肝癌細胞SMMC-7721中的相對表達量為0.024±0.0026，是正常肝細胞L-02表達量0.014±0.0003的1.71倍（P=0.002）；NEK2 mRNA在肝癌組織中的相對表達量為5.60±3.69，是癌旁組織表達量0.34±0.38的16.47倍（P=0.013）；N

11、EK2蛋白在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織（P=0.000）。
　　4.肝癌臨床病理特征分析發(fā)現，NEK2、p-AKT和MMP-2在腫瘤大小≤10 cm組的表達水平均分別是腫瘤大小>10 cm組的1.58倍（P=0.024）、2.24倍（P=0.041）和2.29倍（P=0.013），NEK2和MMP-2在包膜不完整組的表達水平分別是包膜完整組的1.91倍（P=0.000）和2.04倍（P=0.009），NEK2、p-AKT

12、和MMP-2在多結節(jié)組中的表達水平分別是單結節(jié)組的1.62倍（P=0.012）、2.40倍（P=0.046）和2.04倍（P=0.024），NEK2和p-AKT在復發(fā)組中的表達水平分別是非復發(fā)組的2.09倍（P=0.004）和3.24倍（P=0.045）。
　　5.關聯(lián)性分析結果顯示，肝癌組織中NEK2的表達與p-AKT和MMP-2均成顯著正相關，相關系數分別為r=0.832（P<0.01）和r=0.763（P<0.01）。

13、>　　結論：
　　NEK2很可能是具有重要功能的肝癌標志物，并且其表達與肝癌的侵襲轉移有關，可能通過激活PI3K/AKT信號通路增加腫瘤細胞的侵襲轉移能力。
　　第二部分轉錄組結合蛋白組學篩選肝癌潛在標志物HSP90α
　　目的：
　　利用蛋白組學結合轉錄組學的策略篩選肝癌細胞與肝癌血清中共有的差異表達因子，驗證其在肝癌細胞、血清和組織的表達水平，及其與臨床病理特征之間的關系。
　　方法：
　　1.采

14、用iTRAQ-LC-MALDI-TOF/TOF蛋白組學技術對10例人肝癌血清和10例正常對照組血清進行質譜分析，獲得肝癌相關差異表達蛋白。
　　2.將血清蛋白組學與細胞轉錄組學數據進行交集分析，得到共有的差異表達因子，并將差異表達最為明顯的因子列為候選標志物。
　　3.利用qRT-PCR驗證候選標志物HSP90α在肝癌細胞SMMC-7721和正常肝細胞L-02中的表達水平；Western blotting、ELISA驗證HS

15、P90α在7例肝癌血清和7例正常對照血清中表達水平；免疫組化驗證HSP90α蛋白在76例肝癌組織和癌旁組織中的表達水平。
　　4.分析候選標志物HSP90α的表達與76例肝癌樣本臨床病理特征之間的關系。
　　結果：
　　1.蛋白組學結果顯示，在人肝癌血清和正常對照組血清中共鑒定出31個差異表達蛋白，其中在肝癌血清中上調17個，下調14個。
　　2.將血清蛋白組學與細胞轉錄組學的差異表達因子進行交集分析，可以得到3

16、個共有的差異表達因子，在肝癌中表達上調2個，表達下調1個，其中HSP90α在血清蛋白組學與細胞轉錄組學中差異最為明顯，因此將HSP90α基因作為驗證的候選標志物。
　　3.驗證結果顯示，HSP90α mRNA在肝癌細胞SMMC-7721中的表達水平是正常肝細胞L-02表達水平的4.18倍（P<0.05）；Western blotting結果顯示HSP90α蛋白在肝癌血清中的表達水平是正常對照組的7.26倍（P<0.05）；ELIS

17、A結果顯示HSP90α在肝癌血清中的表達量為273.6±20.3μg/ml，也明顯高于在正常對照組血清的表達量186.2±18.3μg/ml（P<0.05）；HSP90α蛋白在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織（P<0.05）。
　　4.肝癌臨床病理特征分析發(fā)現，HSP90α在肝癌轉移組和非轉移組中被判定為強陽性的比例分別為66.7%和25%，在肝癌轉移組中的表達水平顯著高于非轉移組（P=0.010）。
　　結論：

18、　　HSP90α可能是重要的肝癌標志物，并且與肝癌的侵襲轉移有密切的關系。
　　第三部分 NEK2和HSP90α診斷肝癌的價值及生存率分析
　　目的：
　　利用TCGA數據庫中的肝癌患者數據，進一步評估NEK2和HSP90α在診斷肝癌的價值及生存率分析，探討其臨床應用的可行性。
　　方法：
　　1.下載TCGA數據庫中肝癌的RNASeqV2數據，分別計算NEK2基因和HSP90α基因在359例肝癌及癌旁組織

19、中的表達差異性。
　　2. ROC曲線分析，獲得NEK2和HSP90α對肝癌診斷的最佳臨界點、AUC及診斷靈敏度與特異度。
　　3.根據ROC曲線提供的診斷最佳臨界點，將肝癌患者分為NEK2和HSP90α高表達組和低表達組，并利用Kaplan-Meier生存曲線分析NEK2和HSP90α高表達組和低表達組患者的生存率差異。
　　結果：
　　1. NEK2和HSP90α在肝癌組織中的表達均顯著上調，其中NEK2在肝

20、癌組織中的表達水平是癌旁組織的19.036倍（P<0.001），HSP90α是癌旁組織的1.399倍（P<0.001）。與HSP90α相比，NEK2在肝癌組織中表達上調的更為明顯。
　　2. NEK2和HSP90α對肝癌均有較好的診斷準確性，并且NEK2診斷準確性高于HSP90α，其AUC分別為0.960（P=0.003）和0.703（P=0.029）；NEK2和HSP90α對肝癌診斷的最佳臨界點分別為52.73和17971.78

21、；NEK2診斷肝癌的靈敏度和特異度分別為0.98和0.82，HSP90α診斷肝癌的靈敏度和特異度分別為0.88和0.55，與HSP90α相比，NEK2診斷肝癌顯示出更高的靈敏度和特異度。
　　3.生存曲線分析結果顯示，NEK2和HSP90α基因的表達情況均與患者生存率有關（P=0.0145和0.0032），并且高表達組患者生存率低于低表達組。
　　結論：
　　NEK2和HSP90α對肝癌均有較好的診斷價值，NEK2和H