磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板的研制及HBV抗原特異性T細(xì)胞的初步檢測(cè).pdf

1、抗原特異性T細(xì)胞在機(jī)體抗感染、抗腫瘤以及自身免疫性疾病等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其數(shù)量的多少和功能的強(qiáng)弱直接反映了人體特異性細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)。所以抗原特異性T淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)在發(fā)病機(jī)制研究、治療方案選擇和療效觀察以及疫苗效果監(jiān)測(cè)等方面都有著重要的參考價(jià)值。近20年來(lái)，抗原特異性T細(xì)胞的檢測(cè)方法有了快速發(fā)展，從最初的Cr51釋放法、有限稀釋法和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法發(fā)展到了現(xiàn)在的金標(biāo)準(zhǔn)——pMHC多聚體熒光染色及流式分析法，最具特異性和

2、準(zhǔn)確性。但是目前臨床上依然很少對(duì)患者進(jìn)行抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能的監(jiān)測(cè)，原因是pMHC多聚體價(jià)格昂貴，需要流式細(xì)胞儀等特殊儀器;針對(duì)各種HLA基因型以及各種病原體抗原、腫瘤抗原或自身抗原的商品化pMHC多聚體非常缺乏，不成系列，難以滿足對(duì)各種HLA基因型別的患者以及針對(duì)特定病原體的多種抗原表位特異性T細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)際需要;不能高通量地同步進(jìn)行數(shù)量和功能的分析等。所以進(jìn)一步探索操作簡(jiǎn)便、無(wú)需特殊儀器、能同步檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功

3、能的新方法相當(dāng)重要。
　　本課題組前期以直徑為4.5μm的磁珠為載體，包被進(jìn)口的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體制備磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞(aAPC-beads)，在96孔板中同步檢測(cè)OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群中OVA抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和反應(yīng)活性，建立了磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板技術(shù)(aAPC-microplate)并進(jìn)行了方法學(xué)的評(píng)價(jià)，證明了該技術(shù)在無(wú)需特殊儀器條件下的可行性。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的試劑盒

4、化和國(guó)產(chǎn)化，本研究首先對(duì)pMHC多聚體制備技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，自制H-2Kb/OVA單鏈三聚體(SCT)，驗(yàn)證其構(gòu)象與功能;然后用該蛋白替代進(jìn)口的昂貴商品制備aAPC-beads，建立aAPC-microplate，同步檢測(cè)OVA抗原特異性CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量和功能，重新進(jìn)行方法學(xué)論證;最后利用aAPC-microplate技術(shù)初步檢測(cè)慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特異性CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量，主要的結(jié)果如下:
　　1、首次采用重

5、疊延伸PCR和同源重組技術(shù)，無(wú)需限制性內(nèi)切酶和連接酶，成功構(gòu)建 H-2Kb/OVA SCT重組質(zhì)粒，原核表達(dá)SCT蛋白，鎳柱純化，稀釋復(fù)性折疊，繼而通過(guò)鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)將生物素化的H-2Kb/OVA SCT蛋白包被磁珠，制備成H-2Kb/OVA SCT beads。通過(guò)H-2Kb構(gòu)象特異性單抗熒光染色和流式分析驗(yàn)證了該SCT分子的正確空間構(gòu)象;以該SCT分子為基礎(chǔ)構(gòu)建H-2Kb/OVA四聚體，流式檢測(cè)OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群中OVA

6、抗原特異性CD8+T細(xì)胞的比例，與進(jìn)口的H-2Kb-Ig/OVA二聚體檢測(cè)結(jié)果相似(38.09％ vs.35.32％)，提示其與特異性TCR的有效結(jié)合能力。
　　2、利用H-2Kb/OVA SCT beads，在96孔反應(yīng)板中對(duì)OVA抗原特異性CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行磁性分選和計(jì)數(shù)，然后補(bǔ)加ConA培養(yǎng)24h，通過(guò)酶聯(lián)斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OVA抗原特異性CD8+ T細(xì)胞群中分泌IFN-γ的細(xì)胞比例，作為其反應(yīng)活性比。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)細(xì)胞接種數(shù)量

7、組，每個(gè)數(shù)量組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例由復(fù)孔的平均值表示，并對(duì)5個(gè)檢測(cè)數(shù)量組的平均比例進(jìn)行直線回歸方程校正。方法學(xué)的準(zhǔn)確性分析顯示:aAPC-beads在不同細(xì)胞數(shù)量孔中與靶細(xì)胞的結(jié)合以及在磁場(chǎng)下的分選呈現(xiàn)良好的數(shù)量依賴關(guān)系和線性關(guān)系，R2值均達(dá)0.99以上;特異性分析顯示:aAPC-microplate分選后，陽(yáng)性細(xì)胞群中OV抗原特異性CD8+ T細(xì)胞的比例為92.35％和86.39％（兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果）;重復(fù)性分析顯示:在5個(gè)檢測(cè)數(shù)

8、量組之間，陽(yáng)性細(xì)胞比例的平均分析內(nèi)CV值為6.44％和4.01％;對(duì)同一份OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，分析間CV值為3.22％，符合生物制品鑒定標(biāo)準(zhǔn);與經(jīng)典的pMHC多聚體流式分析法相比:兩種方法對(duì)5只OT-1鼠的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p=0.2397，回歸分析顯示兩種檢測(cè)方法的吻合度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組結(jié)果有顯著相關(guān)性，相關(guān)方程為Y=2.229+0.815X，相關(guān)系數(shù)r=0.983，P＜0.01。反應(yīng)活性檢測(cè)結(jié)

9、果顯示:2只OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群經(jīng)aAPC-microp late分選后，OVA抗原特異性CD8+ T細(xì)胞群的反應(yīng)活性比分別為43.83％和41.87％。另外，傳統(tǒng)ELISPOT檢測(cè)OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群經(jīng)OVA抗原肽刺激后分泌IFN-γ的細(xì)胞比例分別為4.44％和4.01％，遠(yuǎn)低于aAPC-microplate方法和經(jīng)典pMHC多聚體流式分析法的檢測(cè)比例。
　　3、利用課題組前期自制的HLA-A*0201/HBc18-27、A

10、*0201/HBe183-191、A*0203/HBc18-27、A*0203/HBe183-191和A*0206/HBc18-27五種單鏈三聚體蛋白，包被磁珠制成五種HLA-A2/HBV beads，利用aAPC-microplate方法對(duì)慢性乙肝患者PBMC中HBV抗原特異性CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量檢測(cè)。初步結(jié)果有:運(yùn)用流式分析和PCR-SBB方法對(duì)20余名慢性乙肝患者進(jìn)行HLA-A2基因分型，得5例HLA-A2陽(yáng)性患者。進(jìn)口HLA

11、-A2/HBV二聚體熒光染色和流式分析顯示:HBc18-27和HBe183-191表位特異性CD8+T細(xì)胞比例分別為0.15％、0.08％、0.25％、0.08％和0.28％; aAPC-microplate檢測(cè)的相應(yīng)比例為0.10％、0.11％、0.28％、0.10％和0.23％。配對(duì)t檢驗(yàn)顯示兩組結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p=0.9454，相關(guān)方程為Y=0.028+0.811X，相關(guān)系數(shù)r=0.893，P＜0.01。
　　本研究首先利

12、用新技術(shù)方案自制了H-2Kb/OVA單鏈三聚體蛋白，具有正確構(gòu)象與功能;然后用其替代昂貴的進(jìn)口商品建立aAPC-microplate方法，同步檢測(cè)OT-1鼠中OVA抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能，完成了方法學(xué)論證，提示了技術(shù)的可行性;最后利用aAPC-microp late技術(shù)初步檢測(cè)慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果與經(jīng)典的進(jìn)口HLA-A2/HBV多聚體流式分析法無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究為下一步制備臨床試劑盒奠