海洋藥用生物星蟲的資源化學與效應物質研究.pdf

1、本論文的研究內容主要包括建立特定的分析方法，對星蟲中的核苷類成分、游離氨基酸類成分，脂肪酸類成分和無機元素類成分進行定性定量檢測以及采用活性跟蹤法對星蟲中一種具有溶栓作用的活性蛋白——星蟲激酶進行提取分離、純化和制備，并對星蟲激酶作用纖維蛋白和纖維蛋白原的作用機理、酶學性質、體內和體外水平的溶栓活性評價以及基于代謝組學對星蟲激酶對動脈血栓形成的作用機制進行研究。
　　本論文共分三章，各章節(jié)的主要內容及研究結果如下:
　　一、

2、文獻研究
　　本部分總結中外學者的研究，簡要介紹了星蟲動物門的由來、分類和星蟲的一般生理生態(tài)活性特征，并對星蟲動物門的資源利用現(xiàn)狀進行分析，肯定了我國在星蟲人工養(yǎng)殖、新藥開發(fā)和利用其作為污染物監(jiān)測方面所取得的成就。重點介紹了星蟲體內已經發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)活性物質、自身生理活性物質和藥理活性物質以及星蟲所具有的藥理活性。
　　二、星蟲資源化學成分評價
　?。ㄒ唬┖塑蘸陀坞x氨基酸類成分資源化學評價
　　為了對星蟲樣品的核苷和

3、游離氨基酸類成分進行資源化學評估，本實驗采用HILIC-UPLC-TQ-MS/MS同時測定了不同產地、不同部位及不同方法處理的19批裸體方格星蟲樣品中的共計16種核苷類成分和25種游離氨基酸類成分。并采用了PCA的分析方法對各樣品之間的差異進行了進一步的比較。結果顯示所建立的測定的方法準確、快速、重現(xiàn)性好。41種成分的檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)范圍分別為0.003-0.229μg/mL和0.008-0.763μg/mL

4、。日內精密度和日間精密度分別＜3.72％和＜3.42％。重復性的結果為＜4.48％，樣品在一天內的0、2、4、8、12、24 h的穩(wěn)定性＜4.92％。加樣回收率的結果為94.03％-106.33％，相對標準偏差(RSDs)為＜3.76％。本實驗中的相關研究成果將為星蟲資源的深入研究和開發(fā)利用提供堅實的理論基礎。
　　（二）脂肪酸類成分資源化學評價
　　為了對星蟲樣品的脂肪酸類成分進行比較和深入研究，本實驗采用氣相色譜-質譜聯(lián)

5、用技術(GC-MS)對12個裸體方格星蟲樣品中的26種脂肪酸進行了含量測定，對結果進行包括PCA分析在內的系統(tǒng)分析。結果顯示所建立的測定方法檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)范圍分別為0.028-0.359mg/mL和0.093-1.197mg/mL。精密度和重復性的結果范圍分別為0.53％-3.12％和0.18％-3.15％，樣品在一天內的穩(wěn)定性范圍為0.78％-3.11％。加樣回收率的結果的范圍為94.20％-105.36

6、％，相對標準偏差(RSDs)范圍為1.13％-3.30％。對裸體方格星蟲樣品的測定結果顯示各樣品26種脂肪酸類成分總含量范圍為198.20-578.05μg/g，總含量最低的樣品是廣西北海的裸體方格星蟲外壁+內臟樣品(S9)，總含量最高的樣品是海南三亞的裸體方格星蟲體腔液樣品(S12);每個產地的裸體方格星蟲的樣本均呈現(xiàn)體腔液部位總含量高于外壁+內臟部位。
　?。ㄈo機元素類成分資源化學評價
　　為了對星蟲樣品的無機元素類

7、成分進行比較和深入研究，本實驗采用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)對采自7個產地的12個裸體方格星蟲樣品中的27種無機元素的種類、含量及所占比例進行了系統(tǒng)的分析，并采用了主成分分析法(PCA)對所得結果進行進一步探索。結果顯示所建立的測定方法檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)范圍分別為0.018-2.386μg/mL和0.060-7.953μg/mL。精密度和重復性的結果范圍分別為0.03％-2.91％和0.69％-2.

8、91％，樣品在一天內的穩(wěn)定性范圍為0.13％-2.83％。加樣回收率的結果的范圍為96.17％-103.30％，相對標準偏差(RSDs)范圍為1.01％-3.30％。用所建立的方法對裸體方格星蟲樣品中的分析結果顯示各樣品總含量范圍為149.01-330.55μg/g，其中采自福建廈門的裸體方格星蟲外壁+內臟樣品(S4)總含量最低，采自海南三亞的裸體方格星蟲體腔液樣品(S12)總含量最高;每個產地的裸體方格星蟲的體腔液的總含量均高于外壁+

9、內臟的總含量;Na、K、Ca、Mg4種常量元素，總量范圍為13.14-133.24μg/g。
　　三、星蟲激酶提取分離純化、酶學性質和體內外溶栓活性及機理研究
　?。ㄒ唬┬窍x激酶提取分離純化研究
　　采用纖溶活性跟蹤的方法從裸體方格星蟲中獲取一種具有溶栓作用的活性蛋白酶——星蟲激酶(SK)。取新鮮裸體方格星蟲，洗凈解剖后以PBS緩沖液為提取液經兩次勻漿(1000r/min，30s)-凍融（20℃，12h冷凍，4℃解凍）

10、-離心(5000 r/min，10 min，4℃)步驟后得到SK粗水提物。以30％-60％硫酸銨沉淀區(qū)間將SK粗水提物進行粗分離，再將經3500 D透析除鹽除雜后的SK粗蛋白分別經Phenyl Sepharose High Performance疏水作用層析、Q Sepharose High Performance陰離子交換層析和Superdex prep grade G-75凝膠過濾層析結合3500 D透析或3000 D超濾等多步精制

11、后得到SK。采用Native-PAGE和SDS-PAGE相結合電泳方法以及凝膠過濾色譜法對SK進行純度鑒定;采用基質輔助激光解吸附聯(lián)合飛行時間質譜法(MALDI-TOF)對SK進行分子量測定;采用經典的Edman降解法對SK進行N端序列測定。結果表明得到的SK的純度分別達到了電泳純和色譜純，分子量為28003.67 D，N端序列為PFPVPDPFVWDTSFQ。
　　（二）星蟲激酶酶學性質研究
　　為探究SK的酶學性質，采用

12、纖維蛋白平板法分別測定SK經不同溫度條件(10、20、30、40、50和60℃)作用，經不同pH緩沖液(pH=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0)作用，與不同金屬離子作用和不同抑制劑作用后的殘余酶活。結果表明對SK的酶學性質的研究結果表明SK在經30-40℃區(qū)間溫度作用后活性最大，60℃作用后基本失活;在pH8-9的范圍內活性最大，pH=11時基本失活;各金屬離子對SK的作用均不顯著，其中Fe2+與SK作

13、用最強，Na+與SK作用最弱;與SK作用的抑制劑中PMSF和Aprotinin與SK作用后，SK活性顯著下降，其余三種均無顯著作用，表明SK是一種絲氫酸蛋白酶。
　?。ㄈ┬窍x激酶對纖維蛋白及纖維蛋白原的作用
　　采用纖維蛋白平板法研究設定的5個濃度的SK對纖維蛋白作用量效關系，以尿激酶為對照，進一步探究SK對纖維蛋白的作用;并采用SDS-PAGE法探究SK對纖維蛋白原的作用機制。結果表明一定劑量范圍內，SK溶解纖維蛋白平板

14、所形成的溶圈大小與其劑量存在一定的量效關系;在富含纖溶酶的未經任何處理的纖維平板上，SK可以通過激活纖溶酶原作用纖維蛋白，在不含纖溶酶的經85℃加熱纖維平板上，SK可以直接作用于纖維蛋白;對與SK分別經5、10和30min以及1、2、4、6、8和16h降解反應后的纖維蛋白原進行凝膠電泳分析后發(fā)現(xiàn)SK通過依次對纖維蛋白原的α鏈、β鏈和γ鏈進行降解而對其起作用的;SK不僅可以直接作用纖維蛋白，還可以通過激活纖溶酶原間接作用纖維蛋白。

15、　?。ㄋ模┬窍x激酶對大鼠動脈血栓形成的作用
　　采用FeCl3刺激誘導的大鼠動脈血栓模型來探究SK對體內血栓形成的作用，通過對動脈血栓質量的測定、HE染色動脈血栓組織形態(tài)學的觀察以及包括凝血四項(APTT、TT、PT和FIB)、血小板最大聚集率(ADP％)以及TXB2、PAI-1、PLG、tPA、CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGF1α和PGI2在內的血液指標的變化進行評估。結果表明一定劑量范圍內，與模型組相比，SK對大

16、鼠動脈血栓的形成具有顯著抑制作用，并能顯著改善血管組織形態(tài)，對動脈血栓模型大鼠的凝血四項（APTT、PT、TT和FIB）、血小板最大聚集率(ADP％)、TXB2、PAI-1、PLG、tPA、CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGF1α和PGI2也均有顯著改善，并且隨劑量遞增，改善作用增強。
　?。ㄎ澹┗诖x組學的星蟲激酶對大鼠動脈血栓形成的作用機理研究
　　本研究中采用UHPLC-Q-TOF-MS分析技術和代謝組學研

17、究方法對動脈血栓模型大鼠在星蟲激酶干預治療下血栓形成過程中大鼠尿液和血漿的代謝組變化進行了研究，從血栓形成過程中內源性物質多元變化，特征標志物上調與下調以及相關代謝通路構建多角度探討和推測星蟲激酶對大鼠動脈血栓形成的作用機制。通過主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別法(PLS-DA)和正交偏最小二乘法(OPLS-DA)對假手術組、動脈血栓模型組以及星蟲激酶給藥組的尿液和血漿樣品進行多元分類分析，結果顯示假手術組、模型組與星蟲激酶給藥組均