黃蜀葵非藥用部位資源化學(xué)及生物轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、黃蜀葵(Abelmoschus Manihot(L.) Medicus)為錦葵科秋葵屬植物，全國大部分地區(qū)均有分布或栽培，首載于《嘉佑本草》。其全株皆可入藥，具有清熱利濕，消腫解毒的功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其對腎炎、心血管疾病和癌癥等具有較好的治療效果。迄今為止已發(fā)現(xiàn)黃蜀葵中資源性成分包括黃酮類、多糖類、有機(jī)酸類、纖維素類以及長鏈烴類等化合物。然而，目前國內(nèi)外有關(guān)黃蜀葵的利用和報(bào)道大部分集中于花和黃酮類化合物的研究，對其根、莖、葉等部位的

2、化學(xué)成分研究較少，資源尚未充分利用。本論文從資源化學(xué)、生物合成和生物轉(zhuǎn)化等方面對黃蜀葵非藥用部位開展研究，為其高效開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。
　　1.黃蜀葵非藥用部位資源性化學(xué)成分研究
　　1.1.總黃酮類資源性化學(xué)成分的分布和動(dòng)態(tài)變化研究
　　采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法，對10個(gè)生長期33個(gè)黃蜀葵根、莖、葉、花樣品中的總黃酮類成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉中總黃酮含量為20.87～50.54 mg/g，明

3、顯高于根和莖，但低于花的含量80.69～92.00 mg/g;對不同生長期樣品含量分析，結(jié)果顯示，隨生長期的延長莖、葉和花中總黃酮含量呈增加的趨勢，但根在中蕾期達(dá)到峰值，隨后含量逐漸減少。黃枯期時(shí)黃蜀葵莖和葉中總含量累積到50～60 mg/g，表明在黃蜀葵花采收后，黃蜀葵莖葉仍可以作為黃酮類成分的重要資源而進(jìn)行開發(fā)利用。
　　1.2.多糖類資源性化學(xué)成分的分布和動(dòng)態(tài)變化研究
　　采用苯酚-硫酸法和咔唑-硫酸法測定黃蜀葵樣品中

4、性多糖和酸性多糖含量，總多糖含量按兩者之和計(jì)算而得。結(jié)果表明，黃蜀葵不同部位中酸性多糖和中性多糖含量隨著生長期的延長而波動(dòng)，整體無明顯變化規(guī)律。與黃酮類成分相比，非藥用部位多糖類成分明顯較高，而藥用部位花中兩類成分含量相當(dāng);就多糖類別而言，中性多糖含量高于酸性多糖，中性多糖含量為28.51～93.44 mg/g，酸性多糖含量為12.63～55.35 mg/g，總多糖含量為43.64～145.29 mg/g。對于不同部位而言，花中多糖類成

5、分含量高于非藥用部位，在生長初期，葉中含量較高，而黃枯期莖中多糖類成分含量較高，三者總多糖含量總和遠(yuǎn)高于藥用部位花。因此開發(fā)廢棄的黃蜀葵根莖葉中多糖類成分對于資源高效利用具有積極意義。
　　1.3.核苷類資源性化學(xué)成分的分布和動(dòng)態(tài)變化研究
　　采用UPLC-TQ-MS/MS技術(shù)分析黃蜀葵10個(gè)采收期的4個(gè)部位（根、莖、葉、花）12種核苷類成分含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃蜀葵不同部位中各核苷含量隨生長期變化而波動(dòng)。不同生長期黃蜀葵不同部

6、位核苷含量有很大差異，總核苷含量為49.90～1901.17μg/g。核苷類成分總量高低順序?yàn)?葉＞花＞莖＞根。各部位都在展葉期時(shí)含量最高。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)4種堿基是12個(gè)目標(biāo)檢測物中含量最高的，高于核苷和核苷酸含量。2'-脫氧尿苷和肌苷含量次之。所有樣品均未檢測出2'-脫氧肌苷，胞苷僅在葉中檢測到，胸苷和2'-脫氧腺苷只在生長初期的根和莖樣品中檢測到。胞苷-5'-單磷酸和2'-脫氧腺苷-5'-單磷酸含量較少。一些常見的嘌呤和嘧啶堿基已被發(fā)現(xiàn)

7、具有細(xì)胞毒性并作為各類腫瘤疾病的治療藥物，因此核苷類成分具有重要的科學(xué)研究意義和應(yīng)用前景。
　　1.4.氨基酸類資源性化學(xué)成分的分布和動(dòng)態(tài)變化研究
　　通過對不同生長期黃蜀葵根、莖、葉和花中22種氨基酸類化合物UPLC-TQ定量測定，發(fā)現(xiàn)根中有17種氨基酸，含量為232.7～3829.4μg/g;莖中有19種氨基酸，含量為334.9～925.9μg/g;葉中有21種氨基酸，含量為1214.0～4222.6μg/g;花中有20

8、種氨基酸，含量為1865.7～4461.9μg/g。黃蜀葵地上部位的氨基酸積累主要發(fā)生在G5到G8，而地下部位根中的積累發(fā)生在G8到G10。此外，非藥用部位中γ-氨基丁酸含量較高，其次是谷氨酰胺、賴氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸，而藥用部位含量較高的是谷氨酰胺、賴氨酸和絲氨酸。由此可見，黃枯期的黃蜀葵非藥用部位根可以用來提取、制備氨基酸類化合物。
　　2.黃蜀葵黃酮類成分生物合成過程研究
　　2.1.前體物的分布和動(dòng)態(tài)變化

9、研究
　　采用UPLC-TQ-MS/MS方法測定前體物苯丙氨酸和酪氨酸，結(jié)果表明，酪氨酸含量高于苯丙氨酸。在不同部位，除個(gè)別生長期樣品外，基本呈現(xiàn)葉＞花＞莖＞根的規(guī)律，且葉和花中的含量明顯高于莖和根。對于不同生長期，根中苯丙氨酸和酪氨酸含量整體變化不大，且兩者含量呈現(xiàn)相同的變化趨勢;莖中苯丙氨酸和酪氨酸變化規(guī)律相似，變化幅度不大;葉中兩種前體物含量變化趨勢差異較大。在G1-G3階段，兩者都呈現(xiàn)先減少后增高的規(guī)律，但在蕾期G3-G5

10、階段，苯丙氨酸含量增高，酪氨酸含量卻降低，開花期間，苯丙氨酸含量波動(dòng)較大，在G5-G6階段，含量迅速減少，在G7盛花期達(dá)到峰值，隨后含量逐漸下降，而酪氨酸含量卻一直升高，在末花期G8達(dá)到峰值，黃枯期時(shí)含量下降;花中苯丙氨酸峰值在盛花期G7，但酪氨酸含量峰值在開花初期G6。兩種前體化合物含量在葉中最高，提示黃蜀葵活性成分的合成部位可能為葉片。此外，推測莽草酸生成預(yù)苯酸后，由預(yù)苯酸生成酪氨酸為主要代謝途徑。
　　2.2.中間體和活性成

11、分的分布和動(dòng)態(tài)變化研究
　　本節(jié)選擇黃酮類成分生物合成途徑中的2種關(guān)鍵中間體（肉桂酸及對羥基肉桂酸）和5種主要黃酮活性成分（金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、槲皮素及楊梅素）作為檢測指標(biāo)，建立了UPLC-TQ-MS/MS聯(lián)用的分析方法，并對黃蜀葵33個(gè)樣品進(jìn)行分析。方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用已建立的方法進(jìn)行相關(guān)樣品中成分含量的檢測具有可行性。檢測結(jié)果顯示，所有采集的樣品中均未檢測到肉桂酸，對羥基肉桂酸在根和莖中含量明顯高于其在葉中的含量

12、。樣品中黃酮苷類成分含量明顯高于苷元類成分含量。5種黃酮活性成分在樣品中含量分布基本規(guī)律為金絲桃苷＞異槲皮苷＞蘆?。鹃纹に兀緱蠲匪?，總黃酮含量在各部位排序?yàn)榛ǎ救~＞莖＞根。花中活性成分含量峰值出現(xiàn)在G8末花期，而葉黃枯期活性成分含量最高，表明花采收后，黃蜀葵非藥用部位葉可以進(jìn)行黃酮類活性成分的提取和制備。
　　2.3.不同生長期不同部位關(guān)鍵酶的活性研究
　　通過對黃蜀葵不同生長期、不同部位的黃酮類成分生物合成途徑中三種關(guān)鍵酶

13、(PAL、C4H和4CL)的酶活性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAL酶活性在葉的G7階段達(dá)到最大值396U/g，其余各部位各生長期該酶活性基本無明顯差異，活性極低，維持在11～118U/g之間。結(jié)合前體物苯丙氨酸和中間體肉桂酸的含量測定結(jié)果，推測黃蜀葵黃酮類成分不是以苯丙氨酸為主要的代謝途徑而合成的。這一結(jié)果也反映了PAL并非黃蜀葵黃酮類成分生物合成過程的限速酶;C4H和4CL均在葉中活性最高，分別為130～3490 U/g和337～2268

14、U/g，顯著高于其它部位，其它部位此兩種酶的活力大小順序?yàn)榛ǎ厩o＞根;在三個(gè)時(shí)期的根樣品中檢測到了4CL的酶活性，其余時(shí)期均未測得。生長初期未開花時(shí)，莖和葉中的4CL含量與對羥基肉桂酸含量呈正相關(guān)，大蕾期之后，兩者呈負(fù)相關(guān)。開花后，葉中4CL活性大幅度增高，從而催化中間體對羥基肉桂酸與輔酶A結(jié)合，有利于黃酮類成分的合成;但藥用部位花中4CL活性卻降低，對羥基肉桂酸含量增高，提示黃蜀葵黃酮類成分的合成可能主要在黃蜀葵葉中完成，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)到花

15、中。
　　3.黃蜀葵內(nèi)生菌和根際微生物對非藥用部位醇提物的生物轉(zhuǎn)化研究
　　3.1.黃蜀葵不同生長期不同部位內(nèi)生菌和根際微生物的種群結(jié)構(gòu)與生態(tài)分布
　　植物內(nèi)生菌和根際微生物是植物體的重要組成部分，影響植物次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。本研究從不同生長期黃蜀葵各部位共分離內(nèi)生細(xì)菌142株，內(nèi)生真菌176株，內(nèi)生放線菌118株;從根際土壤中分離得到細(xì)菌30株，真菌34株，放線菌45株。根據(jù)菌株的形態(tài)特征初步鑒定為內(nèi)生細(xì)菌39

16、種，內(nèi)生真菌47種，內(nèi)生放線菌24種;根際細(xì)菌10種，真菌24種和放線菌13種。其中，葉中內(nèi)生菌數(shù)量最多，且在黃蜀葵的生長初期內(nèi)生細(xì)菌為優(yōu)勢種群，而開花期和黃枯期內(nèi)生真菌比例較大。內(nèi)生菌和根際微生物總數(shù)在黃蜀葵黃酮類成分合成與積累期間，呈現(xiàn)增加的趨勢，即蕾期和花期內(nèi)生菌總數(shù)高于展葉期和黃枯期，最高值出現(xiàn)在中蕾期，內(nèi)生菌菌株最高達(dá)到88株，其中內(nèi)生細(xì)菌達(dá)到34株。
　　3.2.內(nèi)生菌和根際微生物對非藥用部位提取物的生物轉(zhuǎn)化
　

17、　將分離得到的436株內(nèi)生菌和109株根際微生物與黃蜀葵非藥用部位醇提物共培養(yǎng)，利用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)和MetabolynxTM軟件對培養(yǎng)液進(jìn)行檢測分析，初篩實(shí)驗(yàn)共挑選出可能具有轉(zhuǎn)化功能的真菌71株和放線菌22株，將這些菌株進(jìn)行復(fù)篩，共獲得12株具有轉(zhuǎn)化功能的真菌，轉(zhuǎn)化得到代謝產(chǎn)物15個(gè)，主要代謝途徑包括去糖基化、甲基化、去羥基化、甲氧基化、乙?；脱趸茸饔?。結(jié)果表明，采用黃蜀葵內(nèi)生菌和根際微生物對非藥用部位進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化具

18、有一定的可行性，并對其他中藥廢棄物的高效利用具有指導(dǎo)和示范作用。
　　3.3.功能性菌株的分離與形態(tài)學(xué)鑒定
　　采用平板和插片培養(yǎng)法，并結(jié)合菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，對具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)化作用的菌株進(jìn)行初步鑒定，功能性菌株結(jié)果為青霉屬4株、曲霉屬3株、卵形孢霉屬2株、根霉屬1株、卷枝霉屬1株及無孢菌群1株。在不同的生長期，12個(gè)菌株的生態(tài)分布分別為現(xiàn)蕾期2株、中蕾期3株、開花期1株、盛花期2株、末花期2株和黃枯期2株;在不同的分離部位，分