氧自由基-線粒體信號通路在少、弱精子癥發(fā)病中的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　特發(fā)性少精子癥和弱精子癥是男性不育癥的常見類型，二者合并發(fā)生又稱為特發(fā)性少弱精子癥。三者發(fā)病率分別占男性不育的15％、30%和15.1%。雖然國內(nèi)外學(xué)者在其發(fā)病機(jī)制方面進(jìn)行了大量研究，但其確切機(jī)制至今仍未闡明。
　　目前在特發(fā)性少、弱精子癥的發(fā)病學(xué)說中，基因調(diào)控異常中的凋亡學(xué)說和環(huán)境因素中的自由基損傷學(xué)說是研究的熱點(diǎn)。其中線粒體信號通路是一條常見的凋亡通路，但是目前對于此通路與少、弱精子癥關(guān)系的研究卻不夠深

2、入：一方面大多停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過有機(jī)化合物、高溫、缺氧等誘導(dǎo)下制造少弱精子癥模型，作睪丸組織或睪丸精子的檢測，而缺乏來自人類精液的直接分析；另一方面還需要從分子層面上作進(jìn)一步的探討。此外有報(bào)道：25%～40%的不育男性患者精液中可以檢出高水平的氧自由基即活性氧（ROS）。ROS對精子脂質(zhì)膜、運(yùn)動(dòng)能力及DNA具有直接的損害作用，但是其是否作用于線粒體信號通路？目前尚未見報(bào)道。
　　本研究通過分析少、弱及少弱精子癥和正常對照組精液中

3、氧自由基代謝產(chǎn)物MDA含量、抗氧化酶T-SOD及GSH-Px活性、線粒體通路中關(guān)鍵分子（Bcl-2、Bax、CytC和Caspase-3）在精子中的定位和表達(dá)等，探討氧自由基-線粒體通路與少、弱精子癥的關(guān)系。繼而分別加入 ROS、GSH及外源性 CytC與精液共孵育后，研究其對氧自由基-線粒體通路部分指標(biāo)的影響。最后采用化學(xué)合成的Bax-siRNA構(gòu)建載體，篩選出有效干擾序列；轉(zhuǎn)染小鼠睪丸支持細(xì)胞株 TM4，觀察Bax等線粒體通路基因表

4、達(dá)的變化。
　　材料和方法:
　　第一部分：兩次收集精液標(biāo)本，分為正常對照組、少、弱及少弱精子癥組（每次每組各30例）。應(yīng)用TBA法測各組精漿MDA含量；比色法測精漿T-SOD和GSH-Px活性；流式細(xì)胞儀檢測各組精子線粒體膜電位；應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)測精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)；分別采用Real-time PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法，檢測各組精子中Bcl-2、Bax、CytC和Caspase-

5、3的mRNA水平和蛋白表達(dá)。
　　第二部分：收集正常精液30例，分為A組（對照組）、B組（加氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)）、C組（加氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)、終濃度為0.75 mmol/L的GSH）及D組（加氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)、終濃度為1.00 mmol/L的GSH）四組。經(jīng)過2 h和12 h共孵育后，TBA法測各組MDA含量，比色法測T-SOD和GSH-Px活性，Real-time PCR法分別檢測各組Bcl-2、Bax、CytC及Caspase-3的mR

6、NA水平，以及通過CASA檢測各組精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。
　　第三部分：收集正常精液30例，分為A1組（對照組）、B1（加終濃度9.375 mg/L外源性CytC）、C1（加終濃度18.75 mg/L外源性CytC）和D1組（加終濃度37.50 mg/L外源性CytC）四組；收集弱精子癥精液30例，分為A2組（對照組）、B2（加終濃度9.375 mg/L外源性CytC）、C2（加終濃度18.75 mg/L外源性CytC）、D2（加終濃度3

7、7.50 mg/L外源性CytC）四組。經(jīng)過2 h和12 h共孵育后，TBA法測各組MDA含量，比色法測T-SOD及GSH-Px活性，通過Real-time PCR法，分別檢測各組中Caspase-3的mRNA水平，以及通過CASA檢測各組精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。
　　第四部分：針對小鼠Bax mRNA靶序列設(shè)計(jì)四段不同的siRNA序列，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，繼而轉(zhuǎn)染 TM4細(xì)胞，設(shè)立空白對照組（未轉(zhuǎn)染）、陰性對照組、Bax-siRNA

8、（167）、Bax-siRNA（283）、Bax-siRNA（408）、Bax-siRNA（514）組。采用Real-time PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞Bax mRNA的表達(dá)，確定Bax-siRNA（167）、Bax-siRNA（283）為Bax-siRNA的有效干擾序列。針對該兩序列，通過轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞，分別作用48 h和72 h后，Real-time PCR法測定Bax及Bcl-2、CytC、Caspase-3基因mRNA表達(dá)的

9、變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1．與正常對照組相比，少、弱及少弱精子癥組精漿MDA含量顯著增加， T-SOD及GSH-Px活性顯著降低（分別為P<0.05、P<0.01及P<0.05）。其中弱精子癥組最為顯著。
　　2．與正常對照組相比，少、弱及少弱精子癥組精子的JC-1+％顯著降低（均P<0.01）。但三組之間無顯著性差異。
　　3．與正常對照組相比，除了少精子癥組VSL、VCL及VAP無顯著性

10、差異外，其它各組各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)水平均顯著下降（P<0.05）。
　　4．與正常對照組相比，少、弱及少弱精子癥組精子中Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量均顯著降低，Bax、CytC和Caspase-3 mRNA均顯著增高（P<0.05）；少精子癥組CytC和Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量比弱精子癥組明顯增高（P<0.05）。
　　5．與正常對照組比較，Bcl-2蛋白在少、弱及少弱精子癥組中的表達(dá)量均顯著降低，Bax、CytC

11、及 Caspase-3蛋白表達(dá)量均顯著增加（P<0.05）；與弱精子癥組比較，CytC及Caspase-3蛋白在少精子癥組中的表達(dá)量顯著增高（P<0.05）。
　　第二部分:
　　1．與A組比較，B組、C組及D組MDA含量增高，T-SOD及GSH-Px活力降低（分別為P<0.01，P<0.05）；與B組比較，C組及D組MDA含量降低，T-SOD及GSH-Px活力增高（分別為P<0.05，P<0.01）。
　　2．與A組

12、比較，B組、C組精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)水平降低（P<0.01）；與 B組比較，C組、D組精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)水平增高（P<0.05）。
　　3．精子Bcl-2相對表達(dá)量：與A組比較，B組、C組降低（分別為P<0.01， P<0.05）；D組降低，但無顯著性差異。精子Bax、CytC及Caspase-3相對表達(dá)量：與A組比較，B組、C組增高（分別為P<0.01，P<0.05）；D組增高，但無顯著性差異。與B組比較，D組相對表達(dá)量降低（P<0.

13、05）。
　　第三部分:
　　1．與A1組比較，B1、C1、D1組MDA含量逐漸降低，T-SOD及GSH-Px活力逐漸增高，D1組差異顯著（P<0.05）。與A2組比較，B2、C2、D2組MDA含量逐漸降低，T-SOD及GSH-Px活力逐漸增高，C2、D2組差異顯著（分別為P<0.05，P<0.01）。
　　2．與A1組比較，B1組、C1組、D1組精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，但無顯著性差異。與A2組比較，B2組

14、、C2組、D2組精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)呈逐漸增高。C2組、D2組精子總活力及快速前向運(yùn)動(dòng)顯著增高（P<0.05）。
　　3．與A1組比較，B1組精子Caspase-3相對表達(dá)量增高，但無顯著性差異；C1組、D1組增高，差異顯著（分別為P<0.01，P<0.05）。與A2組比較，B2組、C2組增高，但無顯著性差異；D2組增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　第四部分:
　　1．兩種Bax-siRNA轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞48

15、 h和72 h后，與空白對照組比較，Bax、CytC、Caspase-3基因 mRNA表達(dá)水平顯著下降，Bcl-2表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而陰性對照組無明顯改變。
　　2．設(shè)計(jì)的干擾序列Bax-siRNA2（283）對目的基因Bax及線粒體通路其它基因（Bcl-2、CytC、Caspase-3）的干擾效果優(yōu)于干擾序列Bax-siRNA1（167）；轉(zhuǎn)染48 h的干擾效果優(yōu)于轉(zhuǎn)染72 h。
　　結(jié)論:
　　1．

16、特發(fā)性少、弱及少弱精子癥的精液中均檢測出氧自由基的增高和線粒體信號通路分子的異常。少精子癥側(cè)重于凋亡，弱精子癥側(cè)重于氧化損傷。兩者存在CytC分子的差異。
　　2．ROS和GSH對于精子分別具有損害和保護(hù)作用，尤其體現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)參數(shù)的變化。ROS能夠影響精子氧自由基-線粒體通路部分參數(shù)，GSH直接對抗ROS，并且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。
　　3．外源性 CytC在正常及弱精子癥精液中均具有抗氧化作用，并在一定程度上提高弱精子癥的精