大腸桿菌JM101在氧化應(yīng)激狀態(tài)下代謝流量分配的內(nèi)在機制.pdf

1、在超氧化物氧化應(yīng)激條件下，細菌細胞會產(chǎn)生適應(yīng)性的反應(yīng)，我們建立了一個大腸桿菌的細胞模型，通過對于氧化應(yīng)激現(xiàn)象的研究進一步探討了細胞是如何適應(yīng)外界惡劣的環(huán)境變化的。超氧化物能促進產(chǎn)生對菌體自體代謝來說過多的活性氧自由基(ROS)，過量的活性氧自由基會對細胞代謝及其它生理活動會產(chǎn)生不利的影響。為了消除這種不利的影響，細胞需要以一種適當(dāng)?shù)姆绞絹碚{(diào)節(jié)一系列的代謝反應(yīng)，使得細胞的代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)能在一個整體的水平上產(chǎn)生相應(yīng)的代謝應(yīng)激。
　　

2、13C標(biāo)記代謝通量分析方法(MFA)經(jīng)常被用來跟蹤細菌，酵母，絲狀真菌和動物細胞體內(nèi)的中心碳代謝中的細胞內(nèi)代謝通量。碳-13標(biāo)記的代謝物可以在整個代謝系統(tǒng)中被追蹤和監(jiān)控，它們在某些代謝產(chǎn)物的分配可以由二維核磁共振(2D NMR)或用氣相色譜/質(zhì)譜法(GC-MS)的測定。依據(jù)這些測量值，細胞內(nèi)的碳通量可以通過參數(shù)擬合程序進行估算。在我們的實驗中，我們使用的是13C-通量軟件來估算最優(yōu)的流量值，流量值的90％的置信度區(qū)間則是用蒙特卡羅抽樣方

3、法計算的。
　　 在研究中，我們使用MFA的方法用來研究的是大腸桿菌JM101暴露于百草枯(PQ)時的氧化應(yīng)激狀況，百草枯(PQ)是氧化應(yīng)激的一個誘導(dǎo)劑。我們將野生型大腸桿菌JM101細胞分別在正常培養(yǎng)基和含PQ的培養(yǎng)基中進行恒化培養(yǎng)，在進行對兩種狀況下的一些基本生長參數(shù)和代謝產(chǎn)物的生成參數(shù)比較后，我們用穩(wěn)定狀態(tài)下的13c流量分析方法確定在中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝流的分布變化情況。模型中的代謝網(wǎng)絡(luò)途徑包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、

4、三羧酸循環(huán)、回補反應(yīng)和乙醛酸支路以及ED途徑。
　　 在研究中，我們不僅使用了定量的代謝通量分析方法，而且同時測量了代謝中關(guān)鍵酶的基因表達量和它們的活性，以研究大腸桿菌細胞為適應(yīng)被超氧化物一百草枯(PQ)所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激現(xiàn)象時，菌體內(nèi)中心碳代謝所發(fā)生的一系列變化情況，同時對所觀察到的整體流量變化相關(guān)的細胞調(diào)節(jié)機制進行了深入的探討。
　　 我們的流量分析是基于核磁共振(NMR)及質(zhì)譜(MS)的測量結(jié)果和計算機模擬的定量結(jié)果

5、，從而分析當(dāng)大腸桿菌處于百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下時碳中心代謝流重新發(fā)生分配的情況的。糖酵解途徑(EMP pathway)的代謝通量被重新導(dǎo)向到磷酸戊糖途徑(PP pathway)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，乙酸量明顯地增加，與此同時TCA循環(huán)相關(guān)的通量下降，而在乙醛酸支路中的通量又增加。這些整體水平上的通量變化導(dǎo)致了NADPH:NADH的增加和a-酮戊二酸量的積累。
　　 我們在定量了在E.coli處于PQ氧化應(yīng)激的代謝過程中代謝碳通

6、量的一系列變化后，發(fā)現(xiàn)這些變化在相當(dāng)大的程度上是存在著相互關(guān)聯(lián)的，并會導(dǎo)致細胞生理狀態(tài)的系統(tǒng)性的調(diào)整。一個主要的適應(yīng)的調(diào)整是NADPH量的增加和NADH量的減少。這反映了細胞內(nèi)存在一種機制，這種調(diào)節(jié)機制使得細胞能夠在氧化應(yīng)激條件下繼續(xù)生存。我們的研究結(jié)果提供了關(guān)于導(dǎo)致這些系統(tǒng)性變化的代謝通量具體的變化的直接的數(shù)據(jù)。并且表明，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下代謝通量的整體水平上的重新分配可能是通過對關(guān)鍵酶的表達及活性的調(diào)節(jié)加以實現(xiàn)的。
　　 而更

7、具有廣泛意義的是，我們的研究提供了一個實例，對關(guān)于大腸桿菌JM101在正常和氧化應(yīng)激兩種狀態(tài)下的代謝通量的分析呈現(xiàn)了關(guān)于細胞生理狀態(tài)的直接的測量結(jié)果，而同時基因表達和蛋白質(zhì)組的研究則在分子水平上進行了研究。在諸如代謝網(wǎng)絡(luò)這樣一個復(fù)雜的系統(tǒng)，最終決定不同的生理狀態(tài)的分子水平上的反應(yīng)過程，是彼此緊密聯(lián)系和相互耦合的，也就是說，在細胞的生理狀態(tài)和分子狀態(tài)的之間的變化有可能存在著并不總是簡單的，一步一步的對應(yīng)關(guān)系。例如，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的akd的流

8、量減少是與AKGDH的失活相關(guān)聯(lián)，而和AKGDH表達量的減少不相關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有時減少的通量伴隨著沒有變化甚至增加了的各自的基因表達和有關(guān)酶的活性（例如，PGI的步驟和相關(guān)的PGI酶）。這類結(jié)果，突出強調(diào)了不同類型系統(tǒng)水平的研究方法存在著重要的相互補充作用。將這些研究方法結(jié)合在一起，則可以全面和真實的反映微生物是如何應(yīng)對氧化應(yīng)激或其他嚴(yán)重的環(huán)境挑戰(zhàn)的。
　　 總的來說，我們關(guān)于大腸桿菌JM101為了適應(yīng)氧化應(yīng)激，細胞內(nèi)中心碳代謝網(wǎng)