自然老化大鼠椎間盤氧化應(yīng)激狀態(tài)的研究.pdf

1、研究背景：
　　 在我國(guó)乃至全世界范圍內(nèi),腰痛始終在威脅人類的健康。腰痛一直是骨科的常見病,腰痛影響了有很多人的正常生活和工作。雖然導(dǎo)致腰痛的確切病因到現(xiàn)在為止還并不清楚,但人們普遍接受的一個(gè)病因是椎間盤的增齡性改變。隨著年齡的增長(zhǎng),椎間盤逐漸發(fā)生退變,而且退變的速度也在逐漸加快,尤其是腰椎的退變是導(dǎo)致椎間盤源性腰痛的主要原因。
　　 通常認(rèn)為當(dāng)氧自由基的產(chǎn)生與清除之間的平衡被打破時(shí)就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激。這種平衡被打破的因?yàn)?/p>

2、可能來(lái)自體內(nèi)也可能來(lái)自體外,而由此導(dǎo)致的損傷是細(xì)胞衰老的主要因?yàn)?細(xì)胞通過一系列的抗氧化系統(tǒng)抵制自由基來(lái)保護(hù)自己,細(xì)胞外的抗氧化系統(tǒng)也參與抵制和減輕氧化損傷。衰老是一個(gè)多因素作用的過程,氧化應(yīng)激與衰老之間存在重要聯(lián)系,衰老是導(dǎo)致椎間盤退變的一個(gè)重要因素,但是目前對(duì)于自然老化的大鼠椎間盤氧化應(yīng)激狀態(tài)并不清楚,因而本文擬研究自然老化的大鼠椎間盤氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　 目的：
　　 研究自然老化的大鼠椎間盤氧化應(yīng)激狀態(tài),揭示椎間

3、盤增齡性改變與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系,并探討氧化應(yīng)激在椎間盤增齡性改變中的作用。
　　 方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)雄性純種健康SD大鼠(國(guó)家A級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)60只,其中青年組大鼠(3月齡)20只,成年組大鼠(6月齡)20只,老年組大鼠(22月齡)20只,采取動(dòng)脈血,離心后留血清,切取椎間盤組織,制成組織勻漿。
　　 2、每組選5例做組織學(xué)檢測(cè):脫鈣,脫水后作運(yùn)動(dòng)節(jié)段正中矢狀切片,用蘇木

4、素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)以及番紅-固綠(safranino-fastgreen)進(jìn)行椎間盤標(biāo)本染色,并根據(jù)顯微鏡下觀察結(jié)果進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。
　　 3、組織學(xué)評(píng)分:分為5項(xiàng),每項(xiàng)1-3分,最高為15分,最低為5分。分別為纖維環(huán)的細(xì)胞組成,纖維環(huán)形態(tài),纖維環(huán)與髓核交界區(qū),髓核的細(xì)胞組成,髓核的形態(tài)。
　　 4、生物化學(xué)檢測(cè):采用硝酸還原法檢測(cè)椎間盤組織勻漿及血清中一氧化氮(Nitrogenmono

5、xide,NO)的含量；采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定椎間盤組織勻漿及血清中超氧化物歧化酶活力；采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)椎間盤組織勻漿及血清中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量；采用分光光度法測(cè)定血清及椎間盤組織中晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advancedoxidationproteinproducts,AOPP)的含量。
　　 5、統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±

6、S)表示。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較,采用LSD法,P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)青年組大鼠椎間盤內(nèi),完整的近圓形的髓核占據(jù)椎間盤50％以上的區(qū)域。星狀的髓核細(xì)胞均勻的分布于髓核中,纖維環(huán)排列規(guī)則,各層纖維軟骨板呈同心圓狀分布,沒有斷裂,成纖維細(xì)胞分布其間。成年組大鼠椎間盤出現(xiàn)一定程度的退變,髓核呈圓形或不規(guī)則形,在椎間盤內(nèi)占據(jù)的區(qū)域少于1/2,但多于1/3。髓核

7、細(xì)胞的數(shù)量減低,部分成簇分布,纖維環(huán)向內(nèi)膨出、皺縮或破裂的纖維環(huán)低于纖維環(huán)的1/3。成纖維細(xì)胞或軟骨細(xì)胞比例均低于75％,纖維環(huán)與髓核輕度分離。老年大鼠椎間盤進(jìn)一步退變,髓核細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少,殘余細(xì)胞成簇分布,髓核形態(tài)不規(guī)則,纖維環(huán)中軟骨細(xì)胞比例增大,破裂皺縮的纖維增加,纖維與髓核重度分離。方差分析三組椎間盤評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=42.818；P=0.000),組間多重比較提示:青年組評(píng)分顯著小于成年組和老年組(P=0.000；P=0

8、.000),成年組顯著小于老年組(P=0.002)。
　　 2、氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè):
　　 (1)NO檢測(cè)結(jié)果
　　 通過硝酸還原酶法,測(cè)定OD值經(jīng)公式計(jì)算可得到大鼠血清及椎間盤組織勻漿中NO含量。青年組大鼠血清中NO含量為15.1403±3.9712μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為18.6357±16.3681μmol/gprot；成年組大鼠血清中NO含量為15.8841±4.3315μmol/L,椎間盤勻漿中

9、的含量為37.7185±20.6398μmol/gprot;老年組大鼠血清中NO含量為16.0915±4.8031μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為49.1593±28.7779μmol/gprot,隨著年齡的增長(zhǎng),大鼠血清中NO的含量逐漸增加。但青年組、成年組及老年組三組之間差別不顯著(F=0.261,P=0.771)。椎間盤勻漿中NO含量逐漸增高,有顯著差異(F=9.374,P=0.000)。組間多重比較:椎間盤組織勻漿中NO含量老

10、年組和成年組均顯著高于青年組(P=0.000;P=0.010),老年組與成年組之間無(wú)顯著差異(P=0.114)。
　　 (2)SOD檢測(cè)結(jié)果
　　 通過黃嘌呤氧化酶法測(cè)定大鼠血清及椎間盤勻漿中超氧化物歧化酶活力:青年組大鼠血清中SOD活力為187.6387±6.4206U/ml,椎間盤勻漿中的SOD活力為98.5516±24.8518U/mgprot；成年組大鼠血清中SOD活力為182.2228±5.5937U/ml,椎

11、間盤勻漿中的SOD活力為86.5944±26.8894U/mgprot;老年組大鼠血清中SOD活力為179.9398±6.9553U/ml,椎間盤勻漿中SOD活力為69.2931±25.9436U/mgprot,隨著年齡的增長(zhǎng),大鼠血清中SOD的活力有逐漸下降趨勢(shì)?？傮w講,三組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.777,P<0.001)。組間多重比較:青年組顯著高于成年組及老年組(P=0.009；P=0.000)。成年組與老年組之間無(wú)顯著差別(

12、P=0.114)。椎間盤勻漿中SOD活力逐漸減低,有顯著差異(F=6.448,P=0.003)。組間多重比較:椎間盤組織勻漿中SOD活力老年組顯著低于青年組和成年組(P=0.001；P=0.039),青年組與成年組之間無(wú)顯著差異(P=0.150)。
　　 (3)通過硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)大鼠血清及椎間盤MDA含量,青年組大鼠血清中MDA含量為6.7615±2.2892nmol/ml,椎間盤勻漿中的含量為5.4613±3.7

13、687nmol/mgprot；成年組大鼠血清中MDA含量為8.3463±2.7170nmol/ml,椎間盤勻漿中的含量為6.2193±4.1821nmol/mgprot;老年組大鼠血清中MDA含量為12.1078±2.4669nmol/ml,椎間盤勻漿中的含量為8.9931±4.8440nmol/mgprot,隨著年齡的增長(zhǎng),大鼠血清中MDA濃度有逐漸增高的趨勢(shì)?？傮w講,三組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=24.184,P=0.000)。組間多

14、重比較:青年組顯著低于成年組及老年組(P=0.050；P=0.000)。成年組顯著低于老年組(P=0.000)。椎間盤勻漿中MDA濃度逐漸增高,有顯著差異(F=3.760,P=0.029)。組間多重比較:椎間盤組織勻漿中MDA濃度老年組顯著高于青年組和成年組(P=0.012;P=0.045),青年組與成年組之間無(wú)顯著差異(P=0.578)。
　　 (4)AOPP檢測(cè)結(jié)果
　　 通過分光光度法測(cè)定大鼠血清及椎間盤組織勻漿中

15、晚期氧化蛋白產(chǎn)物的含量,青年組大鼠血清中AOPP含量為37.2310±8.9431μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為55.7073±21.2910μmol/mgprot；成年組大鼠血清中AOPP含量為69.2388±17.2419μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為93.3990±25.3464μmol/mgprot；老年組大鼠血清中AOPP含量為82.9855±20.2328μmol/L,椎間盤勻漿中的含量為107.4738±33.05

16、02μmol/mgprot。隨著年齡的增長(zhǎng),血清和椎間盤組織中AOPP的含量呈增加趨勢(shì),血清中三組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.040,P=0.000),椎間盤組織勻漿中三組之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=19.645,P=0.000)組間多重比較:血清中AOPP含量老年組和成年組均顯著高于青年組(P=0.000；P=0.000),老年組與成年組之間有顯著差異(P=0.009)；椎間盤組織均漿中AOPP含量老年組和成年組均顯著高于青年組(P=