DFNA5生物學功能和致聾機制初探.pdf

1、在所有已被克隆的耳聾基因中，DFNA5(Deafness，AutosomalDominantNonsyndromicSensorineural5)是為數(shù)不多的目前為止其生物學功能及致聾機制仍不清楚的基因之一。1995年DFNA5被定位于7號染色體15區(qū)7p15，是第五個被定位的常染色體顯性遺傳性耳聾位點。1998年DFNA5基因被克隆，突變位點也被找到。到目前為止，已有多個DFNA5基因的突變被發(fā)現(xiàn)能夠引起耳聾，盡管這些位點在基因組水平

2、都不一樣，但所有引起耳聾的DFNA5基因突變都在mRNA水平使第8外顯子漏讀從而造成開放閱讀框移框，在繼續(xù)翻譯41個本來并不存在的氨基酸后提前終止。
　　 現(xiàn)在一般認為引起耳聾的DFNA5基因突變是一個功能獲得性(gainoffunction)突變，可能與第8外顯子漏讀引起的錯誤翻譯的41個氨基酸有關，理由如下:1）引起耳聾的DFNA5突變都是顯性突變;2）耳聾相關的突變型DFNA5轉染體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞能夠引起細胞死亡的增

3、加，轉化酵母細胞則引起細胞周期停滯;3）DFNA5基因第5外顯子的一個突變也造成開放閱讀框提前終止，但并不引起耳聾。為了在小鼠中模擬人DFNA5耳聾突變，VanLaerL.及同事利用同源重組敲除小鼠DFNA5第8外顯子，造成開放閱讀框移框從而在繼續(xù)翻譯43個原本不存在的氨基酸后提前終止翻譯（小鼠DFNA5突變錯誤翻譯的43個氨基酸與人DFNA5耳聾突變錯誤翻譯的41個氨基酸沒有同源性）。ABR檢測結果顯示該小鼠并沒有耳聾表型。這也提示我

4、們人DFNA5基因第8外顯子漏讀引起的錯誤翻譯的41個氨基酸可能對耳聾的發(fā)生很重要。
　　 本論文在細胞水平對DFNA5蛋白的生物學功能進行研究，并對DFNA5突變的致聾機制進行初步探討。本文第一部分主要對DFNA5生物學功能進行了研究。我們利用分子克隆方法構建了細胞轉染、酵母雙雜交、GST-pulldown等表達載體。DFNA5在COS7細胞的亞細胞定位表明，野生型DFNA5定位在細胞質中，但是將引起耳聾的DFNA5突變型轉染

5、入細胞中后，貼壁細胞變少，且蛋白在細胞質中定位不均勻，聚集成團。我們用酵母雙雜交、GSTopulldown、IP方法試圖鑒定DFNA5相互作用蛋白。遺憾的是，由于細胞毒性及蛋白容易失活等原因，目前為止沒有得到作用蛋白。
　　 HermannLage等將DFNA5穩(wěn)轉入MeWoETO1細胞系中發(fā)現(xiàn)，轉染有DFNA5的細胞系與對照組相比依托泊苷敏感性降低30-35％。他們利用合成熒光探針DEVD-AFC多肽檢測caspase3活性，