基于多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增及多重鏈置換擴(kuò)增技術(shù)對脊髓性肌萎縮疾病PGD的前期研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩77頁未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy, SMA)是一類由脊髓前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞退行性變而引起的進(jìn)行性、對稱性肢體近端肌無力和萎縮的致死性常染色體隱性遺傳病。約有1/6000-1/10000的發(fā)病率,其在致死常染色體隱性遺傳病中的發(fā)病率僅次于囊性纖維化,在中國南方人群SMA攜帶率為1/35~1/80。SMA的致病基因SMN1存在與其高度同源的SMN2拷貝,二者只有5個(gè)堿基差異,但是目前大多數(shù)研究認(rèn)為這兩個(gè)高度同源的基因在

2、7號(hào)外顯子上的C-T堿基差異是導(dǎo)致二者功能不同的主要原因。至今SMA仍是缺乏有效治療的一種致死性疾病,以往以產(chǎn)前診斷和選擇性流產(chǎn)來預(yù)防SMA患兒出生。然而,胎兒一旦經(jīng)產(chǎn)前診斷的方法診斷為SMA,孕婦將要面臨終止妊娠,這對孕婦及其家庭而言是一個(gè)不堪言的巨大打擊。
  胚胎植入前診斷(preimplantation genetic diagnosis, PGD)是發(fā)展起來的第三代試管嬰兒技術(shù),它能比產(chǎn)前診斷更早的對疾病進(jìn)行診斷。其主要

3、借助輔助生殖技術(shù)( ART)獲取體外培養(yǎng)的胚胎,并從中獲取單個(gè)或數(shù)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)的檢測與診斷,依據(jù)檢測結(jié)果選擇無遺傳缺陷的胚胎移植回母體子宮,從而獲得無遺傳缺陷的妊娠,避免了產(chǎn)前診斷終止妊娠的痛苦。而PGD的取材有限,在很大程度上限制了PGD的順利進(jìn)行,成為了PGD的瓶頸問題之一。
  為了解決這個(gè)關(guān)鍵問題,全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification,WGA)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。目前有多種WGA方法, MDA因

4、其技術(shù)成熟,擴(kuò)增產(chǎn)物濃度高而在PGD領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。而MALBAC作為一種新型的WGA技術(shù),因其可在單細(xì)胞水平高效地檢測單核苷酸變異(SNV)及拷貝數(shù)變異(CNV),正受到越來越多的關(guān)注。針對SMA致病基因的高度同源性,僅有一個(gè)堿基的差異起著決定性作用,因此選擇一個(gè)適宜的全基因組擴(kuò)增方法對于SMA的PGD成功是非常關(guān)鍵的。
  目的:
  本研究通過使用傳統(tǒng)的Sanger測序、微衛(wèi)星分析診斷技術(shù),分別比較MDA、MALBA

5、C單細(xì)胞擴(kuò)增法在PGD中不同的細(xì)胞數(shù)(單細(xì)胞、2個(gè)細(xì)胞、5個(gè)細(xì)胞)的擴(kuò)增成功率、ADO率及對SMA診斷準(zhǔn)確率。從而,優(yōu)化活檢細(xì)胞數(shù),評(píng)估兩種擴(kuò)增方法的優(yōu)劣,建立一種更適合SMA疾病的PGD的體系。
  材料:
  取本研究所建立的2株成纖維細(xì)胞系和本院生殖中心廢棄的胚胎單個(gè)卵裂球細(xì)胞做為研究材料。其中包括:1株SMN1基因純合缺失的SMA疾病成纖維細(xì)胞(S);1株正常人包皮成纖維細(xì)胞(N);SMN1基因正常的廢棄胚胎單個(gè)卵裂

6、球,一共取得277份標(biāo)本。其中,單個(gè)細(xì)胞157份:MALBAC擴(kuò)增組(簡稱L組)78份,MDA擴(kuò)增組(簡稱D組)79份;2細(xì)胞60份:L組30份, D組30份;5細(xì)胞60份:L組30份, D組30份;
  方法:
  1.單細(xì)胞、2細(xì)胞、5細(xì)胞的制備。
  2.對 L組/D組中不同種類、不同數(shù)目的細(xì)胞,進(jìn)行MALBAC/MDA擴(kuò)增。
  3.應(yīng)用Sanger測序法分別對MALBAC、MDA的產(chǎn)物進(jìn)行SMN1,SM

7、N2基因檢測。
  4.應(yīng)用單重?zé)晒釶CR法分別對MALBAC、MDA的產(chǎn)物,擴(kuò)增與SMN1基因緊密連鎖的三個(gè) STR位點(diǎn) D5S1967、GATA141B10和 D5S1491,以進(jìn)行ADO和污染的檢測。
  結(jié)果:
  1.兩種擴(kuò)增方法在總位點(diǎn)的擴(kuò)增成功率( L組95.83%低于 D組98.03%),總的ADO率(L組2.52%低于D組3.75%),總的診斷準(zhǔn)確率(L組94.7%低于D組97.8%)上的比較,差異均

8、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
  2.兩種擴(kuò)增方法在不同起始擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目的組內(nèi)結(jié)果比較。MALBAC擴(kuò)增方法在單細(xì)胞水平與同組中的5細(xì)胞相比的,單細(xì)胞水平的擴(kuò)增成功率更
  低、ADO率更高,診斷準(zhǔn)確率更低,二者對應(yīng)的率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p<0.05)。MDA擴(kuò)增方法在單細(xì)胞水平與同組中的2細(xì)胞或者5細(xì)胞相比,單細(xì)胞水平的擴(kuò)增成功率更低、ADO率更高,診斷準(zhǔn)確率更低,二者對應(yīng)的率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05

9、)。其余組內(nèi)率的兩兩比較差均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
  3.兩種擴(kuò)增方法在相同起始擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目的組間結(jié)果比較。單細(xì)胞水平上:位點(diǎn)擴(kuò)增成功率和ADO率上兩種擴(kuò)增方法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05),但在結(jié)合sanger測序方法對SMA疾病診斷中, MDA擴(kuò)增法的診斷準(zhǔn)確率96.05%(73/76)高于 MALBAC擴(kuò)增法91.7%(67/73),二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.107, p<0.05);2細(xì)胞/5細(xì)胞水平上:兩種擴(kuò)

10、增方法都有類同的診斷準(zhǔn)確率、擴(kuò)增效率、ADO率,以上各率在兩種擴(kuò)增方法之間的比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
  結(jié)論:
  1.首次將MALBAC/MDA結(jié)合傳統(tǒng)的Sanger測序、STR分析檢測方法,對 SMA疾病進(jìn)行 PGD,建立了SMA疾病的高效,穩(wěn)定 MALBAC/MDA的PGD體系,為日后SMA的PGD打下基礎(chǔ)。
  2.在單細(xì)胞水平上,應(yīng)運(yùn)傳統(tǒng)檢測方法(一代測序法和微衛(wèi)星分析)進(jìn)行SMN1致病基因

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論