他莫昔芬緩解包裹性腹膜硬化進(jìn)程中腹膜間皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過(guò)程的機(jī)制研究.pdf

1、在腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)患者中，非生理性的腹膜透析液長(zhǎng)期作用于腹膜，會(huì)導(dǎo)致腹膜損傷，可使腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化即EMT(Epithelial-to-Mesenchymal Transition)，從而進(jìn)一步導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生，甚至進(jìn)展為更加嚴(yán)重、病死率極高的包裹性腹膜硬化(encapsulating peritoneal sclerosis，EPS)，其中涉及到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有TGF-β1/

2、Smad通路、PI3-K/Akt/mTOR等。他莫昔芬，是一種選擇性雌激素受體（selective estrogen receptor modulator，SERM）調(diào)節(jié)劑，已廣泛應(yīng)用于乳腺癌的治療。同時(shí)，有許多臨床研究發(fā)現(xiàn)他莫昔芬具有良好的抗纖維化作用，可有效治療多種纖維化類疾病如特發(fā)性腹膜后纖維化及由腹膜透析導(dǎo)致的包裹性腹膜硬化。其機(jī)制研究熱點(diǎn)主要聚焦在他莫昔芬可以抑制TGF-β1信號(hào)通路而抑制EMT和減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積(accum

3、ulation of extracellularmatrix，ECM)，從而起到抗纖維化作用。
　　目的:
　　通過(guò)細(xì)胞水平的研究，明確他莫昔芬可以抑制高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，探索他莫昔芬對(duì)于高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的可能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制。
　　方法:
　　取正常SD大鼠腹膜，原代培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞，取第3-4代細(xì)胞用于研究。高糖干預(yù)部分:分為正常組、高糖處理組分為三組(30mM，60 mM，120

4、mM)，分別處理24h提取RNA和72h提取蛋白。藥物干預(yù)部分:(1)、60mM高糖誘導(dǎo)EMT，予0.5μM或2μM他莫昔芬處理72h提取蛋白;(2)、60mM高糖誘導(dǎo)EMT，予2μM他莫昔芬或同時(shí)予2μM ER-α阻斷劑組處理1h提取蛋白和處理6h提取RNA;(3)、60mM高糖誘導(dǎo)EMT，予2μM他莫昔芬或同時(shí)予1μM蛋白酶體抑制劑處理1h提取蛋白。蛋白免疫印跡分析(western blot analysis)E-cadherin、

5、α-SMA、Smad2及其快速磷酸化水平、Smad3及其快速磷酸化水平、Smad4蛋白含量的變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)檢測(cè)TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白(collagen-Ⅰ)、纖連蛋白(fibronectin)、Smad2、Smad3、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissue growth factor，CTGF)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activ

6、atorinhibitor1，PAI-1的)mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　高糖處理后細(xì)胞呈現(xiàn)EMT及ECM改變，表現(xiàn)為:E-cadherin的表達(dá)量相較正常對(duì)照組明顯下降，α-SMA的表達(dá)量明顯升高，TGF-β1、collagen-Ⅰ、fibronectin的mRNA表達(dá)明顯升高，且呈濃度相關(guān)性。他莫昔芬能夠改善EMT表現(xiàn)，表現(xiàn)為E-cadherin表達(dá)回升，α-SMA表達(dá)下降，且呈濃度相關(guān)性。他莫昔芬可以降低高糖誘導(dǎo)

7、的Smad2快速磷酸化水平即p-Smad2蛋白水平，抑制CTGF、PAI-1的mRNA的表達(dá)，此抑制作用可被ER-α阻斷劑阻斷。Smad3、p-Smad3及Smad4蛋白水平在他莫昔芬作用下未見明顯改變。他莫昔芬本身不會(huì)對(duì)Smad2蛋白及其磷酸化水平和mRNA水平、CTGF和PAI-1的mRNA水平產(chǎn)生影響，但其對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞可明顯降低快速磷酸化水平，降低CTGF、PAI-1的mRNA表達(dá)水平，蛋白酶體抑制劑可提升p-Smad2/3水