氧化苦參堿對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)性作用的研究.pdf

1、目的:
　　探討氧化苦參堿(OMT)在腎缺血再灌注損傷（RIRI）中的保護(hù)性作用。
　　方法:
　　1、首先進(jìn)行OMT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，以0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml6個(gè)濃度梯度處理人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞，于24h及48h用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。建立RIRI細(xì)胞模型:乏氧盒中無糖無血清培養(yǎng)2h模擬缺血狀態(tài)，放回正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h模擬再灌注狀態(tài)。參考

2、毒性試驗(yàn)結(jié)果，選用高、低兩種濃度OMT預(yù)處理HK-2細(xì)胞，與正常細(xì)胞同時(shí)造模，觀察細(xì)胞形態(tài)差異并檢測(cè)細(xì)胞活力，評(píng)估療效以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。使用最佳實(shí)驗(yàn)濃度的OMT預(yù)處理HK-2細(xì)胞24h后進(jìn)行造模（OMT+IR組），設(shè)置對(duì)照組:control組（正常培養(yǎng)），OMT組（OMT預(yù)處理24h后正常培養(yǎng)），IR組（與OMT+IR組同時(shí)鋪板造模，不加藥）。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并采用CCK-8法測(cè)細(xì)胞活力、流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ

3、-FITC/PI雙染法定量檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡情況，分析比較各組間數(shù)據(jù)，評(píng)估OMT對(duì)于RIRI細(xì)胞模型的作用。qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中PERK/ATF4/CHOP通路相關(guān)mRNA的表達(dá)，探索OMT保護(hù)性作用的可能機(jī)制。
　　2、將32只健康雄性ICR小鼠隨機(jī)分為sham組、OMT組、IR組及OMT+IR組，每組8只小鼠。OMT組及OMT+IR組術(shù)前連續(xù)4天及術(shù)后即刻腹腔注射給藥OMT120mg/kg; sham組和IR組注射生理鹽

4、水0.1ml。建立RIRI動(dòng)物模型:手術(shù)切除右腎，游離左腎血管并以血管夾夾閉50min，腎臟顏色由紅變黑提示阻斷成功，松開阻斷后腎臟顏色由黑變紅提示再灌注成功。IR及OMT+IR組根據(jù)上述方法建模;sham和OMT組僅切除右腎、游離左腎血管，不阻斷血供。再灌注24h后收集血清標(biāo)本及腎臟組織標(biāo)本。檢測(cè)血清中肌酐(Cr)、尿素氮（BUN）水平，評(píng)估腎臟功能;檢測(cè)組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量，評(píng)估氧

5、化應(yīng)激水平;腎臟組織切片HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)的改變，并進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分;Tunel法檢測(cè)腎臟組織細(xì)胞凋亡情況。分析比較各組間數(shù)據(jù)，評(píng)估OMT對(duì)RIRI動(dòng)物模型的作用。通過qPCR的方法檢測(cè)各組小鼠腎臟組織中PERK/ATF4/CHOP相關(guān)mRNA的表達(dá)，驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示:1mg/ml及更低濃度的OMT處理細(xì)胞48h，細(xì)胞活力較control組無明顯差異(P＞0.05)。藥物療效實(shí)驗(yàn)

6、顯示:模型組（包括IR組、OMT+IR組）細(xì)胞活力顯著低于control組(P＜0.01)，OMT+IR組細(xì)胞活力高于IR組(P＜0.05)。模型組顯微鏡下觀察可見明顯細(xì)胞凋亡壞死表現(xiàn)，流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)模型組凋亡細(xì)胞明顯增多，相較對(duì)照組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，OMT+IR組細(xì)胞凋亡比例較IR組有所下降(P＜0.05)。模型組細(xì)胞中相關(guān)mRNA表達(dá)均顯著上升(P＜0.01)。OMT+IR組相關(guān)mRNA表達(dá)上升幅度低于IR組

7、(P＜0.05)。
　　2、OMT+IR組小鼠血清Cr、BUN水平均明顯低于IR組(85.74±5.976 vs127.6±13.210，P＜0.05;28.60±2.805 vs41.46±3.966，P＜0.05);OMT+IR組小鼠腎臟組織中SOD活性較IR組有所升高(109.90±4.498 vs85.50±4.114，P＜0.05)，MDA含量低于IR組(6.033±0.2705 vs7.136±0.4254，P＜0.0

8、5);OMT+IR組小鼠腎臟組織病理學(xué)評(píng)分明顯低于IR組(P＜0.05); OMT+IR組小鼠腎臟組織凋亡細(xì)胞數(shù)較IR組明顯減少(P＜0.01)。相較于假手術(shù)組，模型組小鼠腎臟組織中相關(guān)mRNA表達(dá)均有上升(P＜0.01)。OMT+IR組相關(guān)mRNA表達(dá)上升幅度低于IR組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.OMT可顯著改善RIRI模型HK-2細(xì)胞的活力，減少細(xì)胞凋亡，即OMT對(duì)體外缺氧/復(fù)氧造成的HK-2細(xì)胞損傷有一定的

9、保護(hù)性作用。
　　2.OMT可顯著改善RIRI模型小鼠的腎臟功能、減輕腎臟組織的病理性改變，并能起到抗氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡的作用，即OMT對(duì)缺血再灌注造成的小鼠腎臟損傷有一定的保護(hù)性作用。
　　3.體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)RIRI可使PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路關(guān)鍵mRNA表達(dá)上升;而OMT處理后相關(guān)mRNA表達(dá)下降，故推測(cè)阻礙PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路的激活，可能是OMT抑制細(xì)胞凋亡，減輕RIRI的關(guān)鍵機(jī)制之