脂筏對GABA-,B-受體的調(diào)控機制研究和GABA-,B-受體活性熒光探針開發(fā).pdf

1、脂筏作為細胞膜上信號傳導(dǎo)的平臺目前受到越來越多的關(guān)注，尤其是大量的研究已經(jīng)顯示脂筏對G蛋白偶聯(lián)受體功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與G蛋白偶聯(lián)的GABAB受體定位之脂筏結(jié)構(gòu)中，所以探究脂筏對GABAB受體的影響對揭示GABAB受體的調(diào)控機制具有新的啟示作用。
　　 在本研究中，運用單點追蹤技術(shù)追蹤在異源HEK293細胞中實時追蹤GABAB受體在細胞膜上擴散運動，發(fā)現(xiàn)GABAB受體的擴散特性主要由GABAB2亞基決定。更

2、進一步的，蔗糖密度梯度分析受體在脂筏中的定位顯示GABAB2亞基對受體擴散特性的決定作用取決于該亞基對受體在脂筏中定位的主導(dǎo)作用。因此，脂筏對限制GABAB受體的側(cè)向擴散具有關(guān)鍵的作用。
　　 但是，GABAB受體同脂筏的偶聯(lián)并不是固定不變的。在HEK293細胞中，激動劑GABA能顯著的提高GABAB受體的擴散系數(shù)，這與采用甲基-β-環(huán)糊精 (Methyl-β-cyclodextrin，MCD)破壞脂筏的效應(yīng)相似。與受體擴散特性

3、的變化相對應(yīng)，共聚焦成像觀測受體定位和蔗糖密度離心分析GABAB的梯度分布顯示，在異源細胞和神經(jīng)元細胞中GABAB受體激活之后在脂筏中的定位程度顯著下降。所有結(jié)果共同說明激活GABAB受體會誘導(dǎo)受體轉(zhuǎn)移出脂筏區(qū)域。
　　 隨著GABAB受體脂筏中定位程度的降低，受體所介導(dǎo)的G蛋白依賴的信號通路激活強度被削弱，例如下游Gi/o介導(dǎo)的ERK (Extracellular signal-regulated protein kinase

4、s)磷酸化程度降低和Gqi9融合蛋白介導(dǎo)的IP3 (InositoL-1,4,5-trisphosphate)的產(chǎn)量減少，這些結(jié)果突顯了脂筏正向促進GABAB受體介導(dǎo)的G蛋白信號通路的重要作用。另外，脂筏還能協(xié)助調(diào)控參與GABAB受體信號網(wǎng)絡(luò)的信號分子的時空組織。信號分子隨著活性的改變進入或者離開脂筏區(qū)域，從而決定了信號傳遞動態(tài)的啟動和關(guān)閉。我們的研究掀開了從脂筏的角度詮釋GABAB受體在細胞膜上動態(tài)行為和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新視野，GABAB受

5、體的這種定位特性非常值得重視。
　　 為了在活細胞中直接觀測GABAB受體在細胞膜上的活性和功能并且直接在活細胞中標(biāo)記GABAB受體，基于GABAB受體高親和力的拮抗劑CGP64213的結(jié)構(gòu)，本研究設(shè)計、合成并全面評價了一種活性導(dǎo)向的特異性標(biāo)記細胞膜上GABAB受體的小分子熒光探針即探針1。探針1由三個功能基團構(gòu)成，即靶向定位基團、光親和基團、熒光標(biāo)記基團。探針可以用于光親和性的標(biāo)記在CHO細胞中瞬時表達的GABAB受體。此外，