姜黃素通過(guò)NF-κB通路調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　探討姜黃素（Curcumin）在IL-1β誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）中抑制Ⅱ型膠原、促進(jìn)MMIP-13的調(diào)控作用及其可能機(jī)制，明確姜黃素在骨關(guān)節(jié)炎治療的作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法：
　　1、軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定。
　　2、IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、MMP-13表達(dá)的影響。IL-1β刺激軟骨細(xì)胞24h，RT-qPCR和Western Blotting技術(shù)檢測(cè)Ⅱ

2、型膠原（typeⅡ collagen,COL2A1）及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　3、姜黃素對(duì)IL-1β下調(diào)Ⅱ型膠原、上調(diào)MMP-13表達(dá)的影響。予以50μM濃度的姜黃素干預(yù)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞，Western Blotting檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Ⅱ型膠原及MMP-13蛋白的表達(dá)水平；然后以不同濃度的姜黃素干預(yù)大鼠軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)48h后再次

3、觀察Ⅱ型膠原及MMP-13蛋白的表達(dá)水平，確定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中姜黃素干預(yù)效用最佳的時(shí)間及濃度。
　　4、姜黃素對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞增殖活性的影響。給予IL-1β預(yù)刺激24h后，分為空白對(duì)照組、Curcumin組、PDTC組和Curcumin+PDTC組，藥物不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)軟骨細(xì)胞，CCK8檢測(cè)比較四組軟骨細(xì)胞增殖能力的差異。
　　5、姜黃素在調(diào)控IL-1β下調(diào)Ⅱ型膠原、上調(diào)MMP-13表達(dá)可能的機(jī)制。IL-1β加或不加姜黃素

4、刺激軟骨細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，分別提取總蛋白，胞漿蛋白和胞核蛋白，Western Blotting檢測(cè)IκBα、p-IκBα及核內(nèi)外P65的蛋白表達(dá)水平。繼續(xù)取第一代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，分為空白對(duì)照組、IL-1β組、IL-1β+Curcumin組和IL-1β+PDTC(Pyrrol idinedithiocarbamic acid，inhibitor of NF-κB，0.1 mmol/L)組，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組NF-κB(nuclear fac

5、tor-κappaB) p65核內(nèi)外的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　1、成功分離大鼠軟骨細(xì)胞，并通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組化加以鑒定。
　　2、IL-1β顯著增加大鼠軟骨細(xì)胞MMP-13表達(dá)，并顯著降低Ⅱ型膠原mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　3、姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)IL-1β下調(diào)Ⅱ型膠原的表達(dá)，上調(diào)MMP-13的表達(dá)。對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞最佳處理時(shí)間的測(cè)定：在不同時(shí)間點(diǎn)姜黃素干預(yù)下 MMP-13顯著下降，而Ⅱ

6、型膠原顯著增加，MMP-13在36 h達(dá)到峰值，Ⅱ型膠原在48 h達(dá)到峰值。姜黃素對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞最佳處理濃度的測(cè)定：在不同濃度的姜黃素干預(yù)下，明顯上調(diào)Ⅱ型膠原的表達(dá)，并顯著抑制 IL-1β預(yù)處理中軟骨細(xì)胞MMP-13表達(dá)，姜黃素對(duì)Ⅱ型膠原和MMP-13表達(dá)調(diào)控的最佳濃度為50μM。
　　4、姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)IL-1β抑制軟骨細(xì)胞增殖活性。IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞藥物干預(yù)治療后增殖活性逐漸增加，而IL-1β單獨(dú)處理的軟骨細(xì)

7、胞增殖活性逐漸降低。雖然每個(gè)藥物干預(yù)組細(xì)胞增殖活性顯著升高，但各治療組間軟骨細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著差異。
　　5、姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)IL-1β下調(diào)Ⅱ型膠原的表達(dá)，上調(diào)MMP-13的表達(dá)可能是通過(guò)抑制NF-κB通路調(diào)控的。IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞，NF-κB p65核內(nèi)移表現(xiàn)增加，姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)NF-κB p65核內(nèi)移，顯著上調(diào)p65在核外的表達(dá)，使胞漿蛋白p65表達(dá)水平明顯下降。與NF-κB抑制劑(PDTC)具有相似的功能。此外，姜黃素能

8、夠拮抗IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞IκBα的磷酸化，抑制p-IκBα水平上升。
　　研究結(jié)論：
　　1、IL-1β抑制軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、促進(jìn)MMP-13的表達(dá)。
　　2、姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞下調(diào)Ⅱ型膠原、上調(diào)MMP-13表達(dá)效應(yīng)，在這里我們選用最佳的作用時(shí)間和濃度為48 h和50μM。
　　3、姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)IL-1β抑制軟骨細(xì)胞增殖活性，在實(shí)驗(yàn)濃度無(wú)明顯細(xì)胞毒副作用。
　　4、姜黃素通過(guò)抑制I