CASC2在腎細(xì)胞癌中的功能和調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身惡性腫瘤的3％，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)和乳頭狀腎細(xì)胞癌是最常見的RCC類型，在腎癌中的比例分別為60％～85％和7％～14％。RCC其起源于腎小管上皮細(xì)胞。局限性腎癌患者中約有30％會在術(shù)后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，而腎癌發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的機(jī)

2、制尚不清楚。癌易感性候選基因2(cancer susceptibility candidate2，CASC2)是屬于長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，定位于染色體的10q26，最初發(fā)現(xiàn)CASC2在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)，起到抑癌基因的作用，外源性上調(diào)CASC2的表達(dá)可以顯著抑制未分化的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長，CASC2還可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，但是，CASC2在RCC中的表達(dá)情況及其功能尚不清楚。微小

3、RNA(microRNA，miRNA)也是非編碼RNA分子，其在細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期等生物進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，有研究表明lncRNA是新的miRNA作用靶點(diǎn)，本研究檢測了CASC2在RCC組織、癌旁正常腎組織及腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CASC2在RCC的表達(dá)明顯下降，起到抑癌基因作用;miRNA-21(miR-21)以順序特異性的方式下調(diào)CASC2的表達(dá);通過miR-21調(diào)節(jié)CASC2表達(dá)可以部分消除CASC

4、2介導(dǎo)的腫瘤抑制作用。因此，CASC2可能是RCC新的預(yù)后標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)。
　　第一部分 CASC2在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義
　　目的:
　　研究RCC癌組織及癌旁組織中CASC2的表達(dá)，不同RCC細(xì)胞株中CASC2的表達(dá)，探討CASC2在RCC的可能作用。
　　方法:
　　采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Quantitative PCR， qPCR)檢測32例癌組織和癌旁組織

5、中CASC2的表達(dá)水平。根據(jù)病理分期，患者預(yù)后，分析其相關(guān)性。檢測RCC細(xì)胞株786-O、A498和人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)中CASC2基因表達(dá)情況，并對其進(jìn)行比較和相關(guān)分析。
　　結(jié)果:
　　qPCR結(jié)果顯示:RCC組織與相應(yīng)癌旁正常腎組織中的CASC2表達(dá)有差異，在RCC組織中CASC2的表達(dá)明顯均低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;分析了CASC2表達(dá)水平與病理分期的關(guān)系:發(fā)現(xiàn)CASC2低表達(dá)的比例在低分期組(pT1

6、+pT2)中較低，高分期組(pT3+pT4)較高，分別是44.8％(13/29)和66.7％(2/3);Kaplan-Meir生存曲線分析發(fā)現(xiàn)CASC2高表達(dá)組患者的預(yù)后明顯優(yōu)于CASC2低表達(dá)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CASC2在RCC細(xì)胞株786-O、A498中的表達(dá)明顯低于HEK293細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　RCC組織和RCC細(xì)胞株中CASC2的表達(dá)明顯降低，表明CASC在腎癌中起到抑癌基因的作用。隨著

7、腫瘤進(jìn)展分期升高，CASC2低表達(dá)的比例越高，CASC2低表達(dá)組患者預(yù)后不佳，CASC2低表達(dá)可能是患者預(yù)后不佳的標(biāo)志物。
　　第二部分 調(diào)控CASC2表達(dá)水平對腎細(xì)胞癌增殖和遷移的影響
　　目的:
　　通過檢測上調(diào)CASC2表達(dá)對RCC細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，驗(yàn)證CASC2在RCC中的作用。
　　方法:
　　構(gòu)建高表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CASC2;通過高表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CASC

8、2轉(zhuǎn)染上調(diào)CASC2表達(dá)后，使用MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察786-O和A498細(xì)胞株的增殖、遷移是否受影響。
　　結(jié)果:
　　pcDNA3.1(+)-CASC2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，786-O和A498細(xì)胞的OD值分析表明細(xì)胞增殖明顯減少;同樣，過表達(dá)CASC2可以明顯抑制786-O和A498細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)論:
　　上調(diào)CASC2的表達(dá)水平可以抑制RCC細(xì)胞的增殖和遷移，CASC2有腫瘤抑制作用。

9、　　第三部分 miR-21可特異性結(jié)合CASC2并調(diào)控其功能
　　目的:
　　本研究通過生物信息學(xué)分析尋找CASC2的關(guān)聯(lián)miRNA，確認(rèn)其與CASC2特異性結(jié)合能力和靶向調(diào)控作用。
　　方法:
　　根據(jù)miRanda(http://www.microrna.org)和miRcode(http://www.mircode.org)數(shù)據(jù)庫，通過計(jì)算機(jī)輔助得出CASC2具有潛在的miR-21結(jié)合位點(diǎn)。用miR-21

10、mimic模擬miR-21高表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告分析786-O和A498細(xì)胞株中miR-21高表達(dá)對CASC2表達(dá)水平的影響，進(jìn)而檢測CASC2對786-O和A498的腫瘤抑制作用是否受miR-21干擾影響。
　　結(jié)果:
　　通過生物信息學(xué)分析CASC2具有miR-21的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因分析確認(rèn)在CASC2-WT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，miR-21高表達(dá)可以明顯抑制相應(yīng)的熒光活性，而在突變組(CASC2-MUT) miR-2