SOCS1基因在大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞內(nèi)毒素耐受中的作用.pdf

1、內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance，ET)是指預(yù)先給予小劑量LPS或類似物質(zhì)刺激機體或單核巨噬細(xì)胞等先天免疫細(xì)胞后，機體或細(xì)胞對致死劑量的LPS表現(xiàn)為低反應(yīng)性或無反應(yīng)性的現(xiàn)象。ET具有保護作用，能使機體促炎癥反應(yīng)下調(diào)，減輕器官損傷，降低病死率。內(nèi)毒素耐受大鼠體內(nèi)脾臟CD11c1owCD45RBhigh等調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞(regulatory dendritic cells，DCregs)與正常大鼠相比顯著增加，將其過繼治

2、療大鼠急性肝衰竭可降低大鼠死亡率及體內(nèi)炎癥水平。我們推測具有抗炎作用的樹突狀細(xì)胞在內(nèi)毒素耐受狀態(tài)的形成中發(fā)揮著重要作用。DCregs是具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能，可誘導(dǎo)T細(xì)胞低反應(yīng)性，介導(dǎo)免疫耐受。JAK/STAT通路的激活對于細(xì)胞分泌炎性因子和炎癥介質(zhì)至關(guān)重要，細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cytokine signaling1，SOCS1)是負(fù)調(diào)控JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最重要的抑制因子。我們推測樹突狀細(xì)胞細(xì)

3、胞內(nèi)SOCS1基因的高水平表達是內(nèi)毒素耐受形成的機制之一。
　　基于內(nèi)毒素耐受的免疫機制和樹突狀細(xì)胞的功能特性，我們設(shè)想內(nèi)毒素耐受的形成和發(fā)揮保護作用依賴于樹突狀細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達變化導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞發(fā)揮抑制炎癥作用。文中從以下幾方面進行論述：
　　一、構(gòu)建SOCS1基因沉默的大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞
　　目的:篩選出能成功沉默大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(bone marrow deriveddendritic c

4、ells，BMDC)內(nèi)SOCS1基因的干擾序列，構(gòu)建SOCS1基因沉默的大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞。
　　方法:1、分離、純化大鼠骨髓干細(xì)胞，置于完全培養(yǎng)基中（RPMI-1640加10％胎牛血清）體外培養(yǎng);培養(yǎng)過程中加入GM-CSF+IL-4，隔天半定量換液，培養(yǎng)至第5天;相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況;
　　2、構(gòu)建三種SOCS1-RNAi慢病毒，分別將RNAi陰性對照慢病毒、3種SOCS1-RNAi慢病毒與BMDC共培養(yǎng)

5、3天。采用RT-PCR和Western blot檢測各組BMDC內(nèi)SOCS1的表達情況，篩選具有最佳沉默效果的SOCS1-RNAi慢病毒;
　　3、取BMDC，分為iDC組和SOCS1-iDC組，分別用不處理、負(fù)載序列1的SOCS1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染BMDC，培養(yǎng)3天，觀察細(xì)胞生長情況，檢測其生物學(xué)功能。
　　結(jié)果:1、誘導(dǎo)分化獲得的BMDC具有樹突狀突起，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加突起和分叉更明顯;
　　2、在MOI值為5

6、0時，慢病毒轉(zhuǎn)染可以獲得最佳轉(zhuǎn)染效率，即最佳MOI值為50。在最佳MOI值條件下慢病毒轉(zhuǎn)染的BMDC，RT-PCR發(fā)現(xiàn):陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)染的BMDC表達高水平SOCS1 mRNA;慢病毒2和慢病毒3轉(zhuǎn)染的BMDC中度表達SOCS1mRNM而慢病毒1轉(zhuǎn)染的BMDC極少量表達SOCS1。因此，負(fù)載干擾序列1的慢病毒1具有最佳的SOCS1基因沉默效果，Western Blot檢測結(jié)果也證實了相同的結(jié)論。
　　3、SOCS1-iDC組內(nèi)B

7、MDC的SOCS1基因沉默效果明顯，與iDC組相比該組細(xì)胞表現(xiàn)以下特征:樹突狀結(jié)構(gòu)明顯增多，分叉更多;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明該組細(xì)胞表達高水平MHC-Ⅱ、CD80、CD86，呈現(xiàn)成熟樹突狀細(xì)胞(mature dendriticcells，mDC)的特性;刺激T細(xì)胞增殖能力檢測顯示，SOCS1-iDC組細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖率明顯高于iDC組;SOCS1-iDC組細(xì)胞與iDC組細(xì)胞相比，可明顯降低IL-10的分泌水平，提高IL-12的分泌。<

8、br>　　結(jié)論:利用慢病毒載體負(fù)載SOCS1干擾序列可成功將BMDC內(nèi)SOCS1基因沉默，并表現(xiàn)成熟樹突狀細(xì)胞的表型和功能。
　　二、SOCS1基因在大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞形成內(nèi)毒素耐受中的作用
　　目的:建立大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞內(nèi)毒素耐受模型，并探討SOCS1基因在大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞內(nèi)毒素耐受中的作用。
　　方法:1、將上述BMDC隨機分為四組，分別為未成熟樹突狀細(xì)胞組(imDCs)、成熟樹突狀細(xì)胞組(mDCs

9、)、內(nèi)毒素耐受組(ET-DCs)及實驗組(SOCS1-ET-DCs)。未成熟樹突狀細(xì)胞組:將BMDC置于含細(xì)胞因子的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天;成熟樹突狀細(xì)胞組:將BMDC置于含細(xì)胞因子的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)9天后，加入終濃度為1g/L的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)培養(yǎng)24h，;內(nèi)毒素耐受組:將BMDC置于含細(xì)胞因子的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天后加入10mg/L的LPS培養(yǎng)24h，再加入1g/L的LPS刺激分化24h;實驗組

10、:將BMDC在含細(xì)胞因子的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第5天，加入慢病毒1共培養(yǎng)3天（條件:MOI值為50）后，加入10mg/L的LPS培養(yǎng)24h，再加入1g/L的LPS刺激分化24h。
　　2、顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及其生存狀態(tài)。
　　3、檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物分子(MHC-Ⅱ、CD80、CD86)水平;檢測各組細(xì)胞對T細(xì)胞增殖功能和對T細(xì)胞分泌功能的影響。
　　結(jié)果:1、ET-DCs組的細(xì)胞樹突狀突起和分叉稍微多于iDC組，且兩者

11、遠(yuǎn)少于mDC組中的細(xì)胞樹突狀突起和分叉數(shù)量;而實驗組中樹突狀細(xì)胞表現(xiàn)為類似于mDC組中的細(xì)胞形態(tài)。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測顯示iDC組樹突狀細(xì)胞低度表達MHC-Ⅱ、CD80、CD86;而mDC組的細(xì)胞高水平MHC-Ⅱ、CD80、CD86;與mDC組相比，ET-DCs組細(xì)胞低表達上述因子，差異具有顯著性意義(P＜0.05)，而與iDC相比，ET-DCs組細(xì)胞表面MHC-Ⅱ、CD80、CD86表達水平無明顯差異;而實驗組與ET-DCs

12、組相比，顯著高表達MHC-Ⅱ、CD80、CD86，差異具有顯著性意義(P＜0.05)，表現(xiàn)為成熟樹突狀細(xì)胞的表型特征，且與mDC組相比，無明顯差異。
　　3、樹突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖能力檢測顯示，iDC組、ET-DC組中T細(xì)胞增殖率明顯低于mDC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且ET-DC組增殖率稍低于iDC組，無顯著性意義;與ET-DC組相比，實驗組樹突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖率明顯增高(P＜0.05)，接近成熟樹突狀細(xì)胞組

13、中T細(xì)胞增殖率水平。
　　4、ELISA檢測上清液發(fā)現(xiàn)，iDC組、ET-DC組比mDC組的細(xì)胞分泌IL-10的水平高，分泌IL-12的水平低(P＜0.05);與ET-DC組相比，實驗組中T細(xì)胞分泌IL-10水平降低，分泌IL-12水平升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:內(nèi)毒素耐受狀態(tài)抑制骨髓來源未成熟樹突狀細(xì)胞成熟的作用可以被SOCS1基因沉默所打破，表明SOCS1基因的存在對于骨髓來源未成熟樹突狀細(xì)胞建立內(nèi)毒素耐受狀態(tài)必不可