洛伐他汀非膽固醇依賴機制性神經(jīng)保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：史他汀類藥物對神經(jīng)退變性疾病的臨床治療已引起高度重視，但其作用機制仍不十分清楚。為此，本研究采用體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞，觀察他汀類中的洛伐他汀是否能對抗β-淀粉樣肽（β-Amyloid peptide，Aβ）、岡田酸(Okadaic acid,OKA)、氟化物等引起的神經(jīng)毒性作用，重點研究洛伐他汀對阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）發(fā)病中的關鍵物質(zhì)，如淀粉樣前體蛋白（Amyloid Precursor Prot

2、ein，APP）的代謝、尼古丁型乙酰膽堿受體（Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）表達及絲裂體活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路等的作用，了解其相互作用關系，探討他汀類藥物非膽固醇依賴性神經(jīng)保護的分子作用機制。
　　方法:選擇原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細胞及過表達APP670/671的SH-SY5Y細胞，用洛伐他汀、Aβ、OK

3、A、氟化物、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular signal regulated protein kinases,ERK）抑制劑、α7 nAChR受體拮抗劑等分別或合并處理培養(yǎng)細胞24-48小時。采用CCK-8試驗檢測細胞的存活率；用生物化學方法測定細胞內(nèi)膽固醇含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性、及丙二醛（Methane dicarboxylic aldehyde,MDA）含量；

4、用蛋白印跡法（Western blotting）檢測細胞中nAChR?7、?4、?3、β2等亞單位蛋白表達水平，APP代謝途徑中α分泌型淀粉樣前體蛋白（α-Form of secreted APP，αAPP）、β分泌型淀粉樣前體蛋白（βAPP）、β淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-Site amyloid precursor protein-cleaving enzyme1，BACE1）、β淀粉樣前體蛋白裂解酶2（BACE2）及解聚素金屬蛋白

5、酶結構域蛋白10（Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein10，ADAM10）等的蛋白表達水平，ERK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）及p38磷酸化及總蛋白表達水平；實時熒光定量PCR（Real-time PCR）測定nAChR亞單位的mRNA表達水平；用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。所獲實驗數(shù)據(jù)用SPSS18.

6、0統(tǒng)計軟件包進行分析，采用單（或多）因素方差分析和配對t檢驗對數(shù)據(jù)進行處理。
　　結果：
　?。?）細胞模型：結果顯示，原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細胞純度約達到85％，過表達APP670/671的SH-SY5Y細胞中APP的蛋白及mRNA表達水平均明顯高于野生型細胞；用0.1μM的洛伐他汀處理，未觀察到細胞毒性作用，膽固醇水平亦未見明顯改變，故選擇該濃度處理細胞。
　　（2）洛伐他汀的抗神經(jīng)毒性作用：用0.5μM Aβ寡聚

7、體（β-Amyloid peptide oligomers，AβOs）、20nM OKA、及20mg/L氟處理神經(jīng)細胞48h，可分別引起細胞存活率下降、SOD的活性降低和MDA的含量增高等毒性作用；0.1μM洛伐他汀預處理24h，能分別減輕A?Os、OKA及氟化物等引起的細胞毒性作用；
　?。?）洛伐他汀對nAChRs的作用：0.1μM洛伐他汀24h預處理能使α7 nAChR蛋白及mRNA表達水平升高，而α4、α3和?2未見明顯改

8、變。
　　（4）洛伐他汀對APP代謝的作用：0.1μM洛伐他汀24h預處理能使αAPP的分泌增加、βAPP的分泌減少、BACE1蛋白表達水平降低、而BACE2和ADAM10的蛋白表達水平增高。
　?。?）洛伐他汀對MAPK信號轉導通路的作用：0.1μM洛伐他汀24h預處理可使phospho-ERK1/2蛋白表達水平升高，而ERK1/2、JNK和p38總蛋白表達水平未發(fā)生明顯變化，phospho-JNK和phospho-p38

9、蛋白表達水平亦未見明顯改變。
　?。?）洛伐他汀、ERK、α7 nAChR及αAPP的相互關系：聯(lián)合應用洛伐他汀與ERK1/2抑制劑U0126或α7 nAChR拮抗劑MLA處理神經(jīng)細胞，結果顯示，U0126處理神經(jīng)細胞，可以抑制phospho-ERK1/2的磷酸化，降低α7 nAChR蛋白表達水平，減少αAPP的分泌；同時，U0126可以阻斷洛伐他汀引起的MAPK/ERK1/2信號轉導通路活化、α7 nAChR蛋白表達水平升高以及

10、αAPP分泌增加等作用。MLA處理神經(jīng)細胞，僅能減少αAPP的分泌，對其自身的蛋白表達及phospho-ERK1/2的磷酸化均無明顯影響；而MLA與洛伐他汀共同處理細胞，僅可見到洛伐他汀誘導的αAPP分泌增加作用被減弱，而MAPK/ERK1/2的活化以及α7 nAChR蛋白表達水平的上調(diào)均未被減弱。
　　結論：
　?。?）低濃度的洛伐他汀（0.01及0.1μM）處理大鼠海馬神經(jīng)細胞及過表達APP670/671的SH-SY5Y

11、細胞，不產(chǎn)生明顯細胞毒性，亦不引起細胞膽固醇水平的改變。
　?。?）洛伐他汀能減少A?、OKA及氟化物誘導的神經(jīng)細胞死亡、SOD的活性降低和MDA的水平增高；
　　（3）洛伐他汀可引起MAPK/ERK1/2信號轉導通路活化、α7 nAChR蛋白表達水平升高以及αAPP分泌增加，其作用機制可能為，首先活化phosphor-ERK1/2信號轉導通路，該通路的活化刺激α7 nAChR的表達，最終增強APP的非淀粉樣代謝過程，活化α