急性心肌梗死后Exosomes-miR-30a細胞間傳遞調(diào)節(jié)心肌自噬的機制研究.pdf

1、第一部分急性心肌梗死患者血清中Exosome s/miR-30a的表達水平
　　目的：有研究表明循環(huán) microRNA存在于外泌體（Exosomes）中參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，如急性心肌梗死等，然而與自噬特異基因Bec lin-1相關(guān)聯(lián)的miR-30a是否由外泌體攜帶，且它在急性心肌梗死中的作用尚未明確。本實驗的目的是觀察外泌體攜帶的miR-30a在急性心肌梗死患者血清中的表達。
　　方法：選取以“胸痛”為主要癥狀入院

2、的患者145人，其中明確診斷為冠脈陰性患者（對照組）24人，不穩(wěn)定心絞痛患者20人，急性心肌梗死患者101人，抽取患者入院后第二日清晨及急性心肌梗死患者不同時間點靜脈血提取血清。使用相對實時定量PCR方法對患者血清和血清內(nèi)外泌體中miR-30a的表達水平進行檢測，通過蛋白印跡法和流式細胞學檢測血清中外泌體的表達水平。各組數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：急性心肌梗死患者血清中 miR-30a的表達水平存在時間依賴性。不穩(wěn)定型心絞痛和急

3、性心肌梗死24小時患者血清內(nèi)外泌體（特異標記其表面標志蛋白CD63）的表達量相對對照組明顯增高（2.64±0.27、2.94±0.53 P<0.01)。急性心肌梗死患者血清內(nèi)外泌體表面標志蛋白CD63的水平存在時間依賴性。心肌梗死患者血清外泌體內(nèi)攜帶的miR-30a的水平在心肌梗死4小時、24小時明顯增高，存在時間依賴性。
　　結(jié)論：循環(huán)miR-30a由外泌體攜帶，并在急性心肌梗死患者血清中高表達。
　　第二部分 Exoso

4、me s/miR-30a在細胞間的傳遞及其對缺氧心肌細胞自噬水平的調(diào)節(jié)作用
　　目的：最近有研究表明，自噬在缺血性心臟疾病中發(fā)揮保護作用，然而心肌缺血后自噬的調(diào)節(jié)機制尚不明確。外泌體是一種納米囊泡，可攜帶多種microRNA在細胞間傳遞。本實驗?zāi)康脑谟谟^察外泌體攜帶的miR-30a在缺氧心肌中的表達，缺氧心肌分泌的外泌體在細胞間的傳遞，其攜帶的缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α對miR-30a的調(diào)節(jié)，以及影響外泌體和 miR-30 a的

5、釋放對心肌細胞自噬的調(diào)節(jié)，來證明外泌體攜帶的miR-30a在細胞間傳遞對缺氧心肌細胞自噬水平的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：體外培養(yǎng) H9C2大鼠心肌細胞系，構(gòu)建心肌細胞缺氧模型。通過相對實時定量PCR法對缺氧心肌細胞內(nèi)和細胞分泌至培養(yǎng)基中外泌體內(nèi)miR-30a的水平進行檢測，心肌細胞轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA和加用HIF-1α抑制劑2ME后使用Real-time PCR法檢測缺氧心肌細胞內(nèi)miR-30a的水平。使用蛋白印跡法和流式細胞

6、學檢測缺氧心肌細胞分泌外泌體的水平。將缺氧心肌分泌的外泌體與正常培養(yǎng)心肌細胞共培養(yǎng)，通過Real-time PCR法檢測心肌細胞內(nèi)miR-30a的表達水平。使用PKH67試劑使缺氧心肌細胞分泌的外泌體作色，通過激光共聚焦顯微鏡觀察外泌體在細胞間的傳遞。將經(jīng)pCT-CD63-GFP轉(zhuǎn)染的H9C2細胞種植入Transwell培養(yǎng)板上室，將未轉(zhuǎn)染心肌細胞種植入下室，使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察外泌體在細胞間的傳遞。將pSELECT-GFP-m

7、LC3轉(zhuǎn)染入心肌細胞，并將心肌細胞分別三組，分別為對照組，轉(zhuǎn)染miR-30a抑制劑組和使用外泌體抑制劑DMA組，通過激光共聚焦顯微鏡觀察缺氧心肌細胞自噬水平隨時間的改變，使用蛋白印跡法檢測自噬特異標志物 Bec lin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的水平，同時使用Real-time PCR法檢測自噬特異標志物Beclin-1和Atg5的水平，分別觀察三組心肌細胞自噬水平隨時間的變化以明確缺氧心肌細胞自噬水平隨時間的變化和外泌體攜帶的miR-30a對

8、缺氧心肌自噬水平的調(diào)節(jié)。使用TUN EL法分別分析三組心肌細胞的凋亡。
　　結(jié)果：缺氧誘導(dǎo)心肌細胞內(nèi)miR-30a高表達，而抑制缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α可抑制缺氧誘導(dǎo)的miR-30a高表達。缺氧后miR-30a可通過外泌體在心肌細胞間傳遞。缺氧可誘導(dǎo)心肌細胞產(chǎn)生自噬，抑制miR-30a和外泌體的釋放可延長缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞自噬持續(xù)時間。同時，抑制miR-30a和外泌體的釋放可增強缺氧引起的心肌細胞凋亡。
　　結(jié)論：外泌體