磷酸類抗原刺激健康人與結核病人外周血γδT細胞中產生IFN-γ和TNF-α細胞數(shù)量的比較.pdf

1、研究背景：結核分枝桿菌（ mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的結核?。╰uberculosis, TB）仍是是目前嚴重危害人類健康的三大感染性疾病之一。如何快速、準確的診斷結核病，是結核病防治的關鍵。然而，目前對結核病診斷的免疫學指標尚缺乏滿意的方法。臨床診斷結核病的傳統(tǒng)方法如結核菌素皮膚試驗、痰抗酸桿菌涂片、痰結核桿菌培養(yǎng)等均存在缺點。近年來，利用酶聯(lián)斑點免疫試驗(enzyme linked immu

2、nospot，ELISPOT)檢測結核菌特異抗原T淋巴細胞的方法，為結核病快速診斷開辟了一條新的思路。目前臨床中使用的檢測結核桿菌感染試劑盒(T-SPOT-TB)，通過ELISPOT技術，選用結核桿菌特異性抗原ESAT6和CFP10刺激外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)，檢測其中能與抗原發(fā)生特異性免疫反應并分泌IFN-γ的T淋巴細胞，以此判斷是否感染Mtb。但這種試劑盒不能

3、區(qū)分隱匿性Mtb感染者（以下簡稱隱感者）與TB患者。目前缺乏鑒別MTB隱感者和活動性TB免疫狀態(tài)的方法。國內外研究證實唑來磷酸（zoledronate，ZOL）、帕米膦酸（pamidronate，PAM）、異戊烯焦磷酸鹽（isopentenyl pyrophosphate，IPP）等磷酸類抗原可體外優(yōu)勢擴增γδT細胞。本實驗室前期研究初步表明結核病患者γδT細胞受磷酸類抗原一羥基二甲基二烯基四雙磷酸銨鹽［( E)1-Hydroxy-2-

4、Methyl-but-2-enyl4-Diphosphate ammonium salt，HDMAPP］刺激后產生IFN-γ的比例顯著低于健康者及隱感者。
　　目的：用磷酸類抗原刺激健康人、隱感者和TB患者的外周血單個核細胞，比較γδT細胞產生IFN-γ和TNF-α的差異。以闡明健康人、隱感者和TB患者之間γδT細胞免疫功能的差異，為進一步開發(fā)新的臨床結核病檢測試劑盒奠定基礎。
　　方法：1.流式細胞術檢測磷酸類抗原刺激γδ

5、T細胞產生IFN-γ和TNF-α
　　1.1采集3例健康人外周血，分離PBMC后，分別加入不同濃度的IPP、二甲基丙烯焦磷酸鹽（Dimethylallyl pyrophosphate，DMPP）、HDMAPP、ZOL，刺激培養(yǎng)14小時，再加莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6小時后收集細胞。加熒光標記抗體進行表面分子和胞內染色，在流式細胞儀上檢測γδT細胞中表達IFN-γ和TNF-α的比例。
　　1.2采集健康人、隱感者和

6、TB患者的外周血，分離PBMC，用磷酸類抗原刺激培養(yǎng)14小時，再加莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6小時后收集細胞。加熒光標記抗體進行表面分子和胞內染色，在流式細胞儀上檢測各T細胞亞群產生IFN-γ和TNF-α的比例。
　　2. ELISPOT檢測健康人、隱感者和TB患者的外周血PBMC中產生IFN-γ的細胞數(shù)
　　運用結核分支桿菌抗原特異性T細胞ELISPOT診斷試劑盒，從健康人人群中篩選出隱感者。采集健康人、隱感者和

7、TB患者的外周血，分離出PBMC并調整細胞濃度（細胞濃度250萬/ml），按試劑盒設計每孔加入100μl細胞懸液，再加入磷酸類抗原（IPP、ZOL）刺激，將EISPOT培養(yǎng)板放置在37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)20小時，進行顯色，最后用ELISPOT計數(shù)儀進行斑點計數(shù)，計算每25萬個細胞中產生IFN-γ的細胞數(shù)量。
　　3.流式細胞術檢測ZOL誘導健康人和結核患者的γδT細胞擴增情況
　　采集健康人和結核患者的外周血，分離PBMC，調整

8、細胞濃度（100-150萬細胞/ml），加入ZOL刺激，用含10％血清的RPMI-1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)12天后，收集培養(yǎng)的細胞，用流式細胞儀檢測γδT細胞占細胞的比例。比較健康人和結核患者在ZOL誘導前后γδT細胞占細胞的比例的變化。
　　結果:1、不同濃度磷酸類抗原刺激健康人PBMC，用流式細胞術檢測γδT細胞產生IFN-γ和TNF-α的百分比。
　　1.1不同濃度ZOL（終濃度：10μmol/L、20μmol/L

9、、40μmol/L、80μmol/L）刺激健康人的PBMC，γδT細胞產生IFN-γ的百分比分別是6.88±0.37、7.38±0.17、10.59±0.36、9.66±1.04，產生TNF-α的百分比分別是12.18±1.02、13.81±0.002、17.69±0.39、16.48±0.58。
　　1.2不同濃度HDMAPP（終濃度：10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）刺激刺激健康人的PBM

10、C，γδT細胞產生IFN-γ的百分比分別是7.21±0.74、9.65±0.01、15.18±0.42、14.58±0.63，產生TNF-α百分比分別是15.36±2.88、18.35±1.30、26.46±2.64、24.08±0.08。
　　1.3不同濃度IPP（終濃度：5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）刺激健康人的PBMC，γδT細胞產生IFN-γ的百分比分別是1.48±1.90、1.75

11、±1.15、3.62±0.29、2.20±1.03，產生TNF-α的百分比分別是2.91±2.18、3.83±2.95、7.95±0.32、4.80±1.48。
　　1.4不同濃度DMPP（終濃度：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）刺激刺激健康人的PBMC，γδT細胞產生IFN-γ的百分比分別是0.45±0.06、0.62±0.16,、0.86±0.03、1.23±0.26，產生TNF-α的百

12、分比分別是0.80±0.02、1.08±0.21、2.27±0.10、3.15±0.53。
　　2、用結核桿菌ELISOPT檢測試劑盒從健康人中篩選出6例隱感者。
　　3、用磷酸類抗原（ZOL、HDMAPP、IPP、DMPP）刺激健康人的PBMC20小時后，用流式細胞術檢測，γδT細胞、αβT細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞中產生IFN-γ和TNF-α的百分比。各組中γδT細胞產生IFN-γ和TNF-α的百分比，要明顯高

13、于αβT細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞中產生IFN-γ和TNF-α的百分比（p＜0.01）。而各組中αβT細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞中產生IFN-γ和TNF-α的百分比進行比較，無明顯差異（P＞0.05）。
　　3.1 ZOL組中γδT細胞、αβT細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞中產生IFN-γ的百分比分別是8.83±2.51、0.02±0.03、0.01±0.03、0.02±0.03，產生TNF-α的百分比分

14、別是17.73±2.79、0.02±0.03、0.03±0.04、0.04±0.03。（p＜0.01）。
　　3.2 HDMAPP組中γδT細胞、αβT細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞中產生IFN-γ的百分比分別是13.46±4.84、0.004±0.009、0.005±0.012、0.03±0.04，產生TNF-α的百分比分別是23.95±5.17、0.01±0.02、0.01±0.03、0.07±0.05。（p＜0.01）

15、。
　　3.3 IPP組中γδT細胞、αβT細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞中產生IFN-γ的百分比分別是6.55±2.75、0.01±0.02、0.01±0.03、0.01±0.03，產生TNF-α的百分比分別是12.06±3.40、0.03±0.03、0.02±0.03、0.03±0.04。（p＜0.01）。
　　3.4 DMPP組中γδT細胞、αβT細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞中產生IFN-γ的百分比分別是

16、，產生IFN-γ的百分比分別是2.20±1.44、0.01±0.01、0.02±0.02、0.001±0.002，產生TNF-α的百分比分別是5.62±2.89、0.03±0.02、0.05±0.04、0.03±0.02。（p＜0.01）。
　　4、用磷酸類抗原（ZOL、IPP）刺激健康人、隱感者和TB患者PBMC后，用流式細胞術檢測γδT細胞中產生IFN-γ和TNF-α的比例。TB患者的γδT細胞經ZOL、IPP刺激后產生IFN

17、-γ和TNF-α的細胞比例要明顯少于健康人和隱感者，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.01）。
　　4.1 ZOL組中健康人、隱感者和TB患者PBMC中γδT細胞中產生IFN-γ的百分比分別是8.83±2.51、9.70±1.94、2.71±1.51，產生 TNF-α的百分比分別是17.73±2.79、18.86±1.77、6.09±3.32。（p＜0.01）。
　　4.2 IPP組中健康人、隱感者和TB患者PBMC中γδT細胞中產

18、生IFN-γ的百分比分別是6.55±2.75、5.54±3.46、2.32±1.03，產生 TNF-α的百分比分別是12.06±3.40、9.60±3.02、4.54±1.70。（p＜0.01）。
　　5、用EISPOT檢測健康人、隱感者和TB患者PBMC經磷酸類抗原（ZOL、IPP）刺激后產生IFN-γ的細胞數(shù)量，其中ZOL組分別是707±253、663±193、139±69， IPP組分別是400±203、391±138、75

19、±46。TB患者的PBMC經磷酸類抗原刺激后產生IFN-γ的細胞數(shù)量要明顯少于健康人和隱感者，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.01）。
　　6、健康人和結核患者的PBMC用ZOL刺激后，培養(yǎng)增殖12天后，γδT細胞占細胞的百分比分別是90.50±2.72、14.30±8.52。差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.01）。
　　結論：
　　1.用磷酸類抗原刺激健康人的PBMC后，主要是γδT細胞產生IFN-γ和TNF-α，而αβT細胞幾