環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒感染對IPEC-J2細(xì)胞的影響及機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒被發(fā)現(xiàn)均與腹瀉密切相關(guān),且存在著共感染現(xiàn)象,在豬腸道病毒流行病學(xué)上越來越引起人們的關(guān)注和重視。環(huán)曲病毒屬于冠狀病毒的一種,在本課題中被用來研究冠狀病毒引起的豬亞臨床腸道疾病所致腸道細(xì)胞機(jī)能變化。薩佩羅病毒和捷申病毒同屬于小RNA病毒科,在本研究中被作為引起豬臨床和亞臨床腹瀉綜合征的小RNA病毒代表,探討腸道感染病毒所致的腸道細(xì)胞機(jī)能變化。LOX-1(Lectin-like oxidized low-dens

2、ity lipoprotein-1),作為Ox-LDL的受體,參與機(jī)體脂質(zhì)代謝,促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng),影響細(xì)胞的生長分裂和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),導(dǎo)致組織損傷,反應(yīng)機(jī)體的疾病病理狀態(tài),被本實(shí)驗(yàn)室先前研究發(fā)現(xiàn)在薩佩羅病毒感染小腸絨毛上皮細(xì)胞(IPEC-J2)的病理過程中呈現(xiàn)明顯上調(diào)。目前關(guān)于不同種屬腸道病毒的比較性研究很少,也未見關(guān)于環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒或捷申病毒引起腸道細(xì)胞機(jī)能性變化的相關(guān)研究。同時(shí),LOX-1雖被證實(shí)與人的炎癥相關(guān)病理變化甚至是癌癥

3、發(fā)生有關(guān),但是,LOX-1是否在病毒引起的慢性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮一定的作用還未可知。因此,我們擬在探究環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒感染IPEC-J2細(xì)胞引起的細(xì)胞病理發(fā)生過程的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討 LOX-1在腸道病毒感染腸道細(xì)胞過程中發(fā)揮的潛在作用及其信號功能。
  1.環(huán)曲病毒的鑒定
  流行病學(xué)調(diào)查顯示,環(huán)曲病毒在上海地區(qū)有流行,感染率為5.5%。在牛環(huán)曲病毒基因組全長的基礎(chǔ)上,我們獲得了豬環(huán)曲病毒的全長基因組序列(283

4、01bp),進(jìn)一步擴(kuò)充了環(huán)曲病毒的有限基因組信息。全長序列中堿基的缺失和替換主要發(fā)生在非結(jié)構(gòu)基因 ORF1a上。和牛環(huán)曲病毒及馬環(huán)曲病毒相比,豬環(huán)曲病毒SH1株分別缺失了28個(gè)堿基和152個(gè)堿基。將陽性糞便樣品回歸感染巴馬小型豬,可觀察到環(huán)曲病毒在感染豬上周期性隨糞便排出,每5~6天為一個(gè)病毒復(fù)制和排毒周期。環(huán)曲病毒還會引起同居感染。未感染豬接觸感染豬3天以上則可被感染并出現(xiàn)排毒現(xiàn)象。這說明通過糞便途徑采集樣品時(shí),一部分感染豬可能處于非

5、排毒期。因此我們認(rèn)為實(shí)際豬場中的環(huán)曲病毒感染率應(yīng)該更高。
  2.捷申病毒的分離鑒定
  捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)在上海地區(qū)的感染率高達(dá)82.2%以上。VP1分型結(jié)果顯示,除了主要血清型4、8和10外,新血清型PTV wild boar/WB2C-TV/2011/HUN流行程度也較高,血清型3和另一血清型PTV SH8比較少。本研究分離出上海主要流行株P(guān)TV4 SH1。PTV4 SH1和PT

6、V410BJ02相似度最高,序列一致性高達(dá)90%。但是,相對于PTV410BJ02,PTV SH1的VP2蛋白缺失了4個(gè)氨基酸序列。SH1株的5’端與PTV8 Jinlin/2003/02和PTV8 Fuyu/2009/02非常一致,都缺乏其他株基因組中的poly(C)序列。
  3.環(huán)曲病毒感染對IPEC-J2細(xì)胞機(jī)制的影響
  本研究應(yīng)用豬環(huán)曲病毒的木瓜樣蛋白酶和3C樣蛋白酶來對環(huán)曲病毒進(jìn)行功能分析。木瓜樣蛋白酶在 IP

7、EC-J2細(xì)胞中主要分布于細(xì)胞核區(qū),3C樣蛋白酶主要定位于細(xì)胞質(zhì)。蛋白酶的表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡,誘導(dǎo)微絲的解聚和消融,細(xì)胞骨架發(fā)生重排,細(xì)胞周期被完全阻礙在G2/M期。在蛋白酶過表達(dá)的IPEC-J2細(xì)胞中,細(xì)胞內(nèi)NO水平提高,胞漿內(nèi)活性氧水平下降,但線粒體內(nèi)活性氧水平上升。蛋白酶還能夠促進(jìn)IFN-α、TNF-α,IL-1α和TGF-β的mRNA水平升高,上調(diào) LOX-1,STAT2和 RIG-I的轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí),環(huán)曲病毒蛋白酶過表達(dá)細(xì)胞

8、中LOX-1和STAT2的蛋白表達(dá)增加。但是RIG-I的蛋白表達(dá)可被蛋白酶所抑制。
  4.薩佩羅病毒感染對IPEC-J2細(xì)胞機(jī)制的影響
  薩佩羅病毒的感染能夠引起IPEC-J2細(xì)胞的漸進(jìn)性變化。在病毒復(fù)制的前期,少量細(xì)胞發(fā)生凋亡;感染24h后,大量細(xì)胞開始進(jìn)入后期凋亡或發(fā)生壞死。病毒感染的末期,細(xì)胞周期多數(shù)停留在G2/M期,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和NO生成呈爆發(fā)式增長。在病毒感染的過程中,宿主細(xì)胞骨架發(fā)生重排,應(yīng)力纖維結(jié)構(gòu)遭

9、到破壞,微絲聚集變粗,并逐漸向細(xì)胞邊界聚攏。細(xì)胞內(nèi)的一系列炎癥相關(guān)細(xì)胞因子也發(fā)生明顯變化。TNF-α轉(zhuǎn)錄水平急劇提升,IFN-α,TGF-β,NF-κΒ和IL-1αmRNA水平也顯著升高(p<0.05)。薩佩羅病毒的增殖可以導(dǎo)致IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)LOX-1、RIG-I和STAT2基因的mRNA水平顯著上調(diào)(p<0.01)。功能蛋白LOX-1、STAT2和RIG-I的表達(dá)呈現(xiàn)為漸進(jìn)性變化。STAT2和LOX-1隨著病毒的感染和復(fù)制呈上調(diào)

10、趨勢,RIG-I蛋白的表達(dá)卻呈現(xiàn)為下調(diào)。
  5.捷申病毒感染對IPEC-J2細(xì)胞機(jī)制的影響
  捷申病毒導(dǎo)致的IPEC-J2細(xì)胞漸進(jìn)性變化與薩佩羅病毒類似,但也呈現(xiàn)出明顯差異。捷申病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)要弱于薩佩羅病毒,引起的細(xì)胞凋亡變化過程、細(xì)胞周期阻礙效應(yīng)和細(xì)胞骨架重組過程也相應(yīng)變慢。捷申病毒復(fù)制過程中活性氧水平的升高呈現(xiàn)為先逐漸升高,再下降,之后又迅速提升。同時(shí),捷申病毒引起的細(xì)胞內(nèi)炎癥細(xì)胞因子和功能基因的轉(zhuǎn)錄變化要顯

11、著弱于薩佩羅病毒,但是功能基因LOX-1,STAT2和RIG-I的蛋白表達(dá)水平要高于薩佩羅病毒。
  6. LOX-1過表達(dá)對IPEC-J2細(xì)胞機(jī)制的影響
  通過研究LOX-1在IPEC-J2細(xì)胞中的功能,我們發(fā)現(xiàn)LOX-1在IPEC-J2細(xì)胞中的過表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞的壞死,導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重組,阻礙細(xì)胞周期的變化,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NO的生成和活性氧水平的升高。在LOX-1過表達(dá)細(xì)胞中,炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IFN-α,TNF-α,IL-

12、1α和TGF-β的轉(zhuǎn)錄水平提高,功能基因RIG-I和STAT2的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)被上調(diào)。將腸道病毒薩佩羅病毒和捷申病毒接種至LOX-1過表達(dá)細(xì)胞中或?qū)OX-1與環(huán)曲病毒蛋白酶基因共表達(dá),病毒的增殖數(shù)量提高,蛋白酶的轉(zhuǎn)錄水平也顯著升高。
  綜上所述,環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒在豬腸道細(xì)胞IPEC-J2中復(fù)制時(shí),可以提升細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重組,阻礙細(xì)胞周期變化,同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和功能基因

13、 LOX-1,STAT2和RIG-I的轉(zhuǎn)錄水平。不同種屬的腸道病毒對IPEC-J2細(xì)胞機(jī)制的影響呈現(xiàn)一定相似性,也存在著一些差異性。這種相似性和差異性對于我們進(jìn)一步研究不同腸道病毒的致宿主細(xì)胞病理發(fā)生發(fā)展過程具有重要的參考意義,同時(shí)也有利于我們進(jìn)一步探索腸道病毒共感染在腸道上皮細(xì)胞機(jī)能變化中的聯(lián)合作用或頡抗作用。LOX-1基因在 IPEC-J2細(xì)胞中過表達(dá)時(shí),可以引起類似病毒感染的細(xì)胞機(jī)能變化,并且明顯促進(jìn)環(huán)曲病毒、薩佩羅病毒和捷申病毒

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