亞硝酸鹽和銨鹽聯(lián)合暴露促進肝癌細胞增殖和侵襲.pdf

1、背景：隨著農(nóng)業(yè)化肥及工業(yè)防腐劑的廣泛應(yīng)用，自然界水體和土壤中氨氮及亞硝態(tài)氮的含量逐年增加。流行病學調(diào)查顯示，氨氮及亞硝態(tài)氮污染嚴重的地區(qū)，癌的發(fā)生率和死亡率逐年增高，提示亞硝酸鹽可能有致癌作用。近年來，亞硝酸鹽的致癌作用受到了質(zhì)疑，動物實驗研究沒有直接的證據(jù)證明亞硝酸鹽就是致癌物質(zhì)，另外卻發(fā)現(xiàn)了其一系列藥用價值，比如降低高血壓和高血脂，保護器官缺血再灌注損傷等。許多學者因此建議將亞硝酸鹽開發(fā)為臨床藥物。關(guān)于這個問題，課題組認為還需要慎重

2、。因為亞硝酸鹽的這些藥用價值是通過其在酸性缺氧環(huán)境中還原成一氧化氮而實現(xiàn)的。腫瘤細胞生活的微環(huán)境呈現(xiàn)缺氧酸性特征，另外腫瘤微環(huán)境是一個高氨環(huán)境，在這樣的微環(huán)境中，亞硝酸鹽也會還原成一氧化氮，對腫瘤細胞有促進作用。迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽在高氨環(huán)境中對腫瘤細胞生物作用的文獻。而揭示亞硝酸鹽和銨鹽共同存在的前提下，腫瘤細胞增殖和侵襲能力會發(fā)生什么變化，對全面了解亞硝酸鹽的生物學作用有著非常重要的意義。
　　目的：探討亞硝酸鹽和銨鹽

3、聯(lián)合暴露對人肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響。
　　方法：實驗分為四組，分別為空白對照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組、亞硝酸鈉和氯化銨混合組。采用MTT實驗檢測細胞活力，篩選出最適處理濃度及最佳處理時間；微管熒光示蹤劑觀察細胞有絲分裂相初步分析細胞增殖情況；劃痕實驗檢測細胞遷移能力；線粒體示蹤劑和微絲示蹤劑熒光顯微鏡下觀察細胞線粒體和微絲變化，檢測細胞運動能力；比色法檢測細胞ATP含量；Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力；活性氧（R

4、OS）檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS水平；ELISA試劑盒檢測鳥氨酸脫羧酶（ODC）的活性；Western Blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、鳥氨酸脫羧酶（ODC）的表達。
　　結(jié)果：⑴亞硝酸鈉和氯化銨聯(lián)合暴露促進肝癌細胞增殖活性的最適濃度和時間確定MTT結(jié)果顯示：亞硝酸鈉、氯化銨、亞硝酸鈉和氯化銨混合物（V:V=1：1）對肝癌SMMC-7721細胞的促增殖活性的最佳濃度皆為150μM，各

5、處理組促增殖活性的適宜時間為24 h，混合組與其它各組相比促增殖活性更加明顯。⑵微管示蹤劑觀察細胞有絲分裂相結(jié)果顯示：亞硝酸鈉組、氯化銨組與對照組相比細胞有絲分裂相略有增加，而混合組與對照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比有絲分裂相明顯增多，混合物組比單獨應(yīng)用亞硝酸鈉有更強的促進肝癌細胞增殖的能力。⑶亞硝酸鈉和氯化銨聯(lián)合暴露增強肝癌細胞遷徙和侵襲能力劃痕實驗結(jié)果顯示：與對照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比，混合組的相對劃痕愈合距離更大,水平運動能

6、力更強；熒光顯微鏡下可見混合組細胞微絲形成大量應(yīng)力纖維，有大量板狀偽足和絲狀偽足的形成，線粒體數(shù)量較其他各組增多；混合組細胞ATP含量增加明顯。Trans well細胞侵襲實驗結(jié)果顯示：混合組穿過基底膜的細胞數(shù)與對照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比明顯增多，侵襲能力增強。Western blotting結(jié)果顯示：與對照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比，混合物組MMP-2和MMP-9的表達量都明顯升高，以上各結(jié)果顯示：混合物組比單純應(yīng)用亞硝酸鈉有

7、更強的增強肝癌細胞遷徙和侵襲的能力。⑷亞硝酸鈉和氯化銨聯(lián)合暴露通過 ROS/ODC途徑增強肝癌細胞遷徙和侵襲能力熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示：亞硝酸鈉組、氯化銨組細胞內(nèi)ROS熒光強度比對照組稍強；亞硝酸鈉和氯化銨混合物組比對照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組細胞內(nèi)ROS熒光強度都明顯增強。ELISA及Western blotting實驗結(jié)果顯示，與對照組和單純亞硝酸鹽組和氯化銨組相比，混合物組鳥氨酸脫羧酶（ODC）的表達