麥冬皂苷D通過CYP2J3-EETs系統(tǒng)發(fā)揮心肌保護作用的分子機制研究.pdf

1、目的：細胞色素P450酶中的CYP2J家族（人源為CYP2J2，鼠源為CYP2J3）廣泛分布于心血管系統(tǒng)、腎臟及肝臟，在心肌中的表達量最高，不僅參與外源性物質(zhì)的代謝，還主要參與內(nèi)源性物質(zhì)花生四烯酸（arachidonic acid, AA）的代謝，并生成四種環(huán)氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids, EETs）代謝產(chǎn)物，包括5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET。EETs是一種

2、內(nèi)源性心血管活性物質(zhì)，具有抑制心肌肥大、凋亡，抗炎、抗氧化、抗心肌缺血、舒張血管、促進心血管生成等廣泛的心肌保護作用。麥冬皂苷D（Ophiopogonin D, OPD）是臨床常用的治療心臟疾病的中藥復方參麥注射液中的主要有效成分之一，本實驗室前期研究初步發(fā)現(xiàn) OPD能顯著誘導大鼠心肌細胞中 CYP2J3的基因表達。因此，本實驗將進一步確證 OPD對 CYP2J3的表達及活性的影響；并從CYP2J3/EETs系統(tǒng)研究 OPD發(fā)揮心肌細胞

3、保護作用的分子機制，通過檢測 OPD對大鼠心肌細胞 H9c2內(nèi) Ca2+穩(wěn)態(tài)及細胞凋亡的影響；并進一步探討 CYP2J3在OPD介導的心肌保護功能中發(fā)揮的作用，以期揭示 OPD的心肌保護作用及其藥理活性機制，為該藥的進一步研究及臨床應用提供理論依據(jù)。
　　方法：（1）用不同濃度 OPD分別處理大鼠心肌細胞，用 MTS檢測細胞存活率，并分別用qRT-PCR及Western-blot檢測CYP2J3的mRNA及蛋白表達，ELISA試劑

4、盒檢測AA代謝產(chǎn)物14,15-DHET(14,15-EET的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物)的含量。（2）用慢病毒載體構(gòu)建CYP2J3穩(wěn)定過表達的H9c2細胞系，qRT-PCR及Western-blot分別檢測CYP2J3過表達或不同EETs處理下對H9c2內(nèi)鈣調(diào)蛋白mRNA和蛋白表達的影響。（3）siRNA敲低CYP2J3的表達，qRT-PCR及Western-blot檢測CYP2J3敲低前后 OPD對 H9c2內(nèi)鈣調(diào)蛋白表達的影響；用 Fluo/4-

5、AM熒光探針標記的H9c2細胞內(nèi) Ca2+，激光共聚焦顯微鏡檢測 CYP2J3敲低前后 OPD對 H9c2胞內(nèi)Ca2+濃度影響的變化。（4）AngII、TG、TM誘發(fā)H9c2細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應及細胞凋亡，qRT-PCR及Western-blot檢測 OPD對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其介導的凋亡分子的影響，Hoechst33258染色及TUNEL凋亡試劑盒從形態(tài)學檢測OPD對AngII誘發(fā)的H9c2細胞凋亡的作用。
　　結(jié)果：（1）0～1μ

6、M OPD對H9c2細胞活力沒有影響，濃度在2.5μM及以上時，會對細胞有不同程度損傷。（2）OPD在低（100 nM）、中（250 nM）、高（500 nM）三個濃度作用于H9c2時，可濃度依賴性的誘導CYP2J3的mRNA及蛋白表達，并可增加其代謝產(chǎn)物14,15-DHET的含量。（3）CYP2J3過表達及不同 EETs處理 H9c2均可有效逆轉(zhuǎn) AngII所致的鈣調(diào)蛋白 SERCA2a、PLB、RyR2及FKBP12.6表達的下降。

7、（4）OPD可逆轉(zhuǎn)AngII所致的H9c2內(nèi)鈣調(diào)蛋白表達的下降及胞內(nèi) Ca2+滲漏，siRNA敲低 CYP2J3表達條件下，OPD對胞內(nèi) Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用明顯降低。（5）OPD能有效抑制 AngII、TG、TM誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其相關(guān)凋亡分子的表達，并能減輕細胞凋亡。
　　結(jié)論：首次研究發(fā)現(xiàn)并證明了 OPD可誘導細胞色素 P450酶 CYP2J3的表達及其代謝產(chǎn)物EETs的含量；且OPD對大鼠心肌細胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作