駱駝單域抗體NBL42框架區(qū)作為CDR3移植骨架的研究.pdf

1、基于單克隆抗體的生物藥物治療已經(jīng)成為應(yīng)對(duì)威脅人類生命尤其是癌癥等疾病的重要手段。大分子單抗存在組織（如實(shí)體瘤）穿透能力差、生產(chǎn)和儲(chǔ)存成本高、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，促使研究人員對(duì)抗體分子進(jìn)行基因工程改造，如小型化（Fab、ScFv以及 Nanobody）或發(fā)展基于新的結(jié)構(gòu)骨架的抗體類似物或模擬物。
　　納米抗體是存在于駱駝血清中的缺失輕鏈的重鏈抗體可變區(qū)片段，是目前天然來源的具有完全抗原結(jié)合功能的最小抗體分子，具有組織穿透能力強(qiáng)、生產(chǎn)成本

2、低、折疊能力強(qiáng)、易于結(jié)合蛋白裂隙表位以及在極端條件下穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。這使得納米抗體成為新一代治療性抗體開發(fā)過程中很有希望的候選分子。此外，納米抗體的單域結(jié)構(gòu)特性，使其成為研究抗體結(jié)構(gòu)與功能以及設(shè)計(jì)新型抗體分子的良好材料。
　　NBL42為本研究組前期從新疆雙峰駝免疫噬菌體展示文庫(kù)中篩選出來的的一個(gè)僅具有CDR3和兩側(cè)框架區(qū)的納米抗體。該抗體對(duì)溶菌酶具有較高的特異結(jié)合活性和顯著的酶抑制活性。分析該抗體序列，發(fā)現(xiàn)除具有較長(zhǎng)的CDR3（

3、17個(gè)氨基酸）外，在 FR3序列中有三個(gè)氨基酸殘基分別與目前已知的VHH抗體FR3區(qū)相應(yīng)氨基酸殘基不同，F(xiàn)R4中有一個(gè)氨基酸殘基與多數(shù) VHH抗體不同。因此設(shè)想能否將該抗體的框架區(qū)作為 CDR3移植的通用骨架。
　　本研究的目的主要有三個(gè)方面：首先，分析NBL42納米抗體結(jié)構(gòu)與抗原結(jié)合活性之間的關(guān)系。其次，驗(yàn)證 NBL42框架區(qū)能否作為CDR3移植肽抗體的通用骨架。最后，采用CDR移植方法制備抗CD47肽抗體，并對(duì)其進(jìn)行活性分析。

4、以期開發(fā)基于駱駝單域抗體的通用小分抗體片段移植架構(gòu)，對(duì)今后新型抗體的設(shè)計(jì)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本研究的主要內(nèi)容包括以下三部分：
　　1．分析 NBL42納米抗體結(jié)構(gòu)與抗原結(jié)合活性之間的關(guān)系
　　首先采用DNA重組技術(shù)制備NBL42蛋白。以NBL42-LH的基因?yàn)槟０澹?PCR擴(kuò)增出不含前導(dǎo)區(qū)和鉸鏈區(qū)的NBL42基因片段，構(gòu)建到pET30a表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白后再經(jīng)過Ni柱純化，經(jīng)ELISA驗(yàn)證，去除了前導(dǎo)區(qū)

5、和鉸鏈區(qū)的NBL42納米抗體與溶菌酶仍有較高的結(jié)合能力，非競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法測(cè)得其親和力常數(shù)（Kd）為8.33×10-7 mol/L。測(cè)得NBL42的IC50值為14.01μg/mL，顯示其抑菌效果良好，且具有很高的酶抑制活性。NBL42納米抗體在95℃能夠保留64.60％的活性，說明VHH的CDR3衍生而來的抗體可以保留很好的熱穩(wěn)定性和高親和力。
　　其次通過ELISA實(shí)驗(yàn)，比較了在大腸桿菌不同部位表達(dá)的納米抗體抗原結(jié)合活性，

6、結(jié)果顯示，可溶性的NBL42蛋白與包涵體形式復(fù)性的蛋白相比，前者有著更好的結(jié)合溶菌酶的活性；包涵體復(fù)性的cAb-Lys3仍然具有與細(xì)胞周質(zhì)cAb-Lys3同樣的抗原結(jié)合活性。
　　2．基于NBL42框架區(qū)結(jié)構(gòu)的CDR3移植肽抗體的抗原結(jié)合活性分析
　　為了確定NBL42抗體的框架區(qū)FR3-FR4作為 CDR3肽抗體移植骨架的可行性，進(jìn)行以下研究：
　　首先將NBL42抗體的FR3-FR4區(qū)作為受體，將 VHHA4抗體的

7、CDR3區(qū)作為供體，構(gòu)建 NBL42-A4CDR3重組抗體的DNA片段，將其連接到pET32a表達(dá)載體上，對(duì)蛋白進(jìn)行表達(dá)純化，ELISA方法檢測(cè)其與溶菌酶及蒜氨酸酶的結(jié)合特性。NBL42-A4CDR3重組抗體成功表達(dá)，ELISA結(jié)果表明，NBL42-A4CDR3獲得了 VHHA4的部分抗原結(jié)合活性，且與溶菌酶不結(jié)合。原來以包涵體形式表達(dá)的VHHA4，在其 CDR3移植到 NBL42的FR3-FR4框架區(qū)之后，獲得了可溶性表達(dá)。NBL42

8、和 VHHA4的CDR3具有接近的氨基酸長(zhǎng)度，除此之外二者序列上沒有明顯的相似性。
　　其次選擇cAb-Lys3（結(jié)合溶菌酶，CDR3有19個(gè)氨基酸）和鼠單克隆抗體B6H12（結(jié)合CD47，即整合素相關(guān)蛋白）作為CDR3序列的供體，選擇NBL42（結(jié)合溶菌酶）的FR3-FR4區(qū)作為CDR3序列的受體。采用全基因合成的方法，合成這兩種CDR3移植肽抗體基因，并構(gòu)建在pET22b(+)表達(dá)載體上。Western Blotting結(jié)果表

9、明，兩種肽抗體均在大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中正確表達(dá)。但ELISA實(shí)驗(yàn)顯示兩種CDR3移植肽抗體不具備結(jié)合相應(yīng)抗原的能力。
　　3.抗CD47肽抗體的制備和活性分析
　　本研究試圖通過CDR移植的方法，尋找適合與抗原CD47結(jié)合的小分子抗體框架，采用了以下兩種策略設(shè)計(jì)抗CD47肽抗體：
　　一是采用文獻(xiàn)報(bào)道的具有CDR移植潛力的納米抗體cAbBCII10（結(jié)合β內(nèi)酰胺酶）作為骨架，將單抗B6H12的VHCDR3移植到cAbBC

10、II10的CDR3區(qū)域，構(gòu)建移植抗體cAbBCII10-B6H12H3，原核表達(dá)后驗(yàn)證其與CD47的結(jié)合能力。二是采用Qiu等的方法，直接將B6H12的VHCDR1和VLCDR3通過VHFR2融合在一起，構(gòu)建CDR嵌合抗體B6H12/H1-FR2-L3，原核表達(dá)后驗(yàn)證其與CD47的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，兩種移植抗體均能在大腸桿菌中表達(dá)。但ELISA實(shí)驗(yàn)表明，cAbBCII10-B6H12和 B6H12/H1-FR2-L3與CD47無特異結(jié)

11、合活性。
　　本研究系統(tǒng)分析了納米抗體NBL42架區(qū)作為 CDR3通用移植骨架的可能性，在對(duì) VHHA4的CDR3的移植中取得了初步成功，獲得了供體抗體的部分抗原結(jié)合特異性，初步表明NBL42具有作為移植骨架的潛力。但是，采用其他三種來源的抗體移植沒有獲得成功，構(gòu)建的肽抗體沒有預(yù)期的抗原結(jié)合活性?？赡芘c移植抗體的CDR3來源和氨基酸組成有密切關(guān)系。今后還需進(jìn)一步分析CDR3序列在移植抗體中的作用，為闡明抗體結(jié)構(gòu)與其活性之間的關(guān)系提