燃煤型過量氟對仔鼠下切牙牙胚鈣調(diào)蛋白NCX3和NCKX4表達(dá)的影響.pdf

1、燃煤型氟中毒是一種典型的地方病，其中貴州省是高發(fā)地區(qū)。鈣穩(wěn)態(tài)的失衡在氟斑牙發(fā)病機(jī)制中已成為研究熱點，但是過量氟對牙齒發(fā)育中鈣穩(wěn)態(tài)的具體影響研究較少。本團(tuán)隊前期對關(guān)于鈣離子通道的相關(guān)因子：Atp1a1、Atp2b1、Cacna1、NCX1進(jìn)行了研究，但是與鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)的兩個關(guān)鍵因子NCX3和NCKX4在本課題組前期的研究中未有體現(xiàn)。本實驗通過復(fù)制燃煤型氟斑牙SD大鼠動物模型，將檢測出生第1、3、5、7、9天仔鼠牙胚組織中的鈣調(diào)蛋白NCX3和

2、NCKX4，進(jìn)一步探索燃煤型氟斑牙發(fā)生與鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)系。另一實驗內(nèi)容是檢測仔鼠血清 ALP，是氟中毒骨組織臨床診斷的生化指標(biāo)的一個因子。檢測仔鼠第1、2、3周血清ALP表達(dá)差異，探索氟中毒對親代仔鼠 ALP活力的影響，進(jìn)一步探索氟中毒對仔鼠的影響。通過本次實驗的研究，為燃煤型氟斑牙的防治提供理論依據(jù)。
　　目的：研究燃煤型氟斑牙仔鼠牙胚組織中NCX3和NCKX4，以及血清ALP表達(dá)與對照組的差異，初步探討這些因子與氟斑牙發(fā)病機(jī)制的關(guān)

3、系以及氟中毒對仔鼠的影響。
　　方法：1.建立動物模型：36只3周齡清潔級SD大鼠，隨機(jī)分為實驗組和對照組，每組18只（雌雄比例2:1）。將實驗組置于模擬燃煤型氟中毒病區(qū)環(huán)境的室內(nèi)，喂養(yǎng)氟含量42.05 mg/kg的飼料。對照組置于普通空氣環(huán)境的室內(nèi)并飼以普通飼料。兩組均飲用自來水。2.檢測內(nèi)容及方法：每周稱量大鼠的體重，對大鼠下切牙唇面正位進(jìn)行拍照記錄，觀察大鼠切牙顏色形態(tài)的變化。同時收集大鼠的尿液和血液，采用電極法檢查血氟和尿

4、氟的變化。動物模型建立成功后，將各組大鼠按雌雄比例2:1合籠交配并產(chǎn)仔。將出生第1、3、5、7、9天仔鼠處死并于體視顯微鏡下取出牙胚。通過HE染色切片觀察成釉細(xì)胞的變化。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測NCX3和NCKX4在牙胚發(fā)育過程中的組織學(xué)定位和半定量。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測NCX3和NCKX4在牙胚發(fā)育不同階段中mRNA的表達(dá)變化。采集第1、2、3周仔鼠血液，檢測ALP水平。
　　結(jié)果：1.成功建立燃煤型氟斑牙SD大鼠動物

5、模型。在第4周，肉眼可見牙體中部有白色斑點或斑塊。在第6周，白色橫紋密集，牙面白堊色區(qū)域超過75％。在第8周，整個牙面呈現(xiàn)白堊色，釉質(zhì)無光澤。2.從第1周到第3周，實驗組仔鼠血清ALP水平逐漸升高，而對照組ALP水平逐漸減低。實驗組血清ALP水平高于同一時期對照組（P<0.05）。3.從病理切片觀察到，對照組成釉細(xì)胞呈柵欄狀緊密排列，分泌期呈高柱狀，成熟期呈矮柱狀。實驗組細(xì)胞腫脹，排列紊亂，半橋粒連接不緊密，細(xì)胞空泡性變。4.免疫組化結(jié)

6、果提示，鈣調(diào)蛋白NCX3、NCKX4在牙胚的成釉細(xì)胞呈陽性表達(dá)，實驗組仔鼠第1、3、5、7、9天鈣調(diào)蛋白NCX3、NCKX4陽性表達(dá)的IOD/AREA值低于對照組（P<0.05或P<0.01）。5.相對定量Real-Time PCR結(jié)果提示，NCX3、NCKX4基因在實驗組仔鼠的第1天表達(dá)升高（P>0.05），第3、5、7、9天表達(dá)降低（P<0.05或P<0.01）。
　　結(jié)論：氟斑牙分子機(jī)制可能是燃煤型過量氟使牙胚鈣調(diào)蛋白NCX